203105. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pirollo-pirimidin-származékok, valamint az e származékokat tartalmazó, daganatos megbetegedések elleni gyógyászati készítmények előállítására
11 HU 203 105 B 12 N-{4-[3-(2,4-diamino-5,6-dihidropirrolo[2,3-d]pirimidin-5-il)-propil]-benzoil}-L-glutamát N-{4-[3-(2-amino-4-hidroxi-5,6-dihidropirroIo[2,3- -d]pirimidin-5-il)-propil]-benzoil}-L-glutaminsav, N-{4-[2-(2-amin(v4-hidroxi-5,6-dihidropiiTolo[2,3-d]pirimidin-5-il)-etil]-benzoil} -L-glutaminsav, N-{4-[3-(2,4-diamino-5,6-dihidropirrolo[2,3-dJpirimidin-ő-ilj-propill-benzoilJ-L-glutaminsav, N-{4-[3-(2,4-diamino-6,7-dihidro5H-pirrolo[2,3-d]pirirnidin-5-il)-l-rnetil-propil]-bcnzűil) -dietil-L-glutamát, N-{4-[3-(2,4-diamino-6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]-pirimidin-5-il)-1 -melil-propil] -benzoil} -L-glutaminsav, N-{4-[3-(2,4-diamino-7H-pirTolo[2,3-d]pirimidin-5- -il)-1 -metil-propil]-benzoil} -dietil-L-glutamát, N-{4-[3-(2,4-diamino-7H-pirrolo[23-d]pirimidin-5- -il)- l-meUl-propil]-benzoil} -L-glutaminsav, N-{4-[3-(2,4-diamino-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5- -il)-2-metil-propil]-benzoil} -L-glutaminsav, N-{4-[3-(2,4-diamino-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5- -il)-1 -etil-propil]-benzoil} -L-glutaminsav, N-{4-[3-(2,4-diamino-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5- -il)-2-etil-propil]-benzoil} -L-glutaminsav, N-{4-[3-(2,4-diamino-6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-il)-2-rnctiI-propil]-benzoiI} -L-glutaminsav, N-{4-[3-(2,4-diamincH6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-il)-l-etil-propil]-benzoil}-L-glutam insav, N- {4-[3-(2,4-diamino-6,7-dihidro-5H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-il)-2-etil-propil]-benzoil} -L-glutaminsav. A találmányunk szerinti eljárással előállított, (I) általános képletű vegyületek nagyon jó hatással alkalmazhatók egér daganatos sejttörzsek ellen (P388, L1210, L5178Y, B16 melanoma, MethA, Lewis Lung Carcinoma, S180 szarkóma, Ehrlich Carcinoma, Colon 38) és emberi daganatos sejttörzsek ellen (HL60, KB, Lu65), visszaszorítják a melegvérű élőlények daganatos sejtjeinek (például melanoma, szarkoma, mastocytoma, carcinoma, neoplasia) szaporodását, és meghosszabbítják a daganatos megbetegedésekben szenvedő, melegvérű élőlények életét. A következőkben a találmányunk szerinti eljárással előállított, (I) általános képletű vegyületek gyógyászati hatását ismertetjük. A későbbiekben ismertetésre kerülő eljárási példákban ismertetett eljárással előállított, (I) általános képletű vegyületek sejtszaporodásgátló hatását (IC50) KB sejtekkel vizsgáltuk. A vizsgálatot a következő eljárással végeztük. Hagyományos eljárással nyert emberi nasopharyngeal daganatos KB sejteket (1 x 104 sejt/ml) oltottunk be egy 96 mikromélyedést tartalmazó lemez mindegyik mélyedésébe (mélyedésenként 0,1 ml) és ezt a tenyészetet 5 térfogat%-os szén-dioxid atmoszférában, 37 "C hőmérsékleten tartottuk 24 órán át. Ehhez ezután hozzáadtuk az eljárási példákban ismertetett eljárással előállított, valamelyik vegyület 10% MÉM tápközegben lévő oldatát (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), majd ismét 5 térfogat%os szén-dioxid-atmoszférában tartottuk 37 ‘C hőmérsékleten, 72 órán át Ezután a tenyészetet kipipctláztuk, és 0,1 ml MTT-t (Dojindo Laboratories) adtunk 10% MEM-ben (l,0mgAnl)a tenyészethez,és37 ’C hőmérsékleten,4órán át inkubáltuk. Ezt követően 0,1 ml 10%-os SDS oldatot (Wako Pure Chemicals) adtunk hozzá, és inkubáltuk 37 *C-on, 24 órán át Ezután mértük az abszorbciót 590 nm-nél, és meghatároztuk a hatóanyag IC» értékét. Az IC» érték az a hatóanyagkoncentráció, amelynél a kifejlődött sejtek száma kezeletlen kontrollcsoportnál kialakult sejtek számához viszonyítva 50%. A kapott eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze. 1. táblázat Vizsgált hatóanyag IC50[pg/ml] 2. eljárási példával előállított hatóanyag 0,0003 4. eljárási példával előállított hatóanyag 0,08 12. eljárási példával előállított hatóanyag 0,0006 A fentiek mellett még a következő kísérleteket végeztük a találmányunk szerinti eljárással előállított, (I) általános képletű vegyületek gyógyászati hatásának vizsgálatára. A 10. eljárási példában ismertetett eljárással előállított hatóanyag sejtszaporodásgátló hatását (IC») a következő eljárással vizsgáltuk HL-60 és HEL sejtekben: 1. HL-60 emberi leukémiasejteket (2 x 105 sejt/ml) szuszpendáítunk a találmányunk szerinti eljárással előállított hatóanyagot tartalmazó GIT tápközegben (Wako Pure Chemicals), és ebből 0,2-0,2 ml-t oltottunk be egy 96 mikromélyedést tartalmazó lemez mindegyik mélyedésébe, és ezt a tenyészetet 5 térfogat%-os szén-dioxid-atmoszférában, 37 *C hőmérsékleten tartottuk 68 órán át. Ezt követőfen az elegyhez 1 pCi [3H]-timidint (5 Ci/mmól) adtunk, és 4 órán át továbbinkubáltuk. A timidin sejthez való kapcsolódását úgy határoztuk meg, hogy üvegszűrőn eltávolítottuk a savban oldhatatlan frakciót, majd folyékony beütésszámlálóval mértük a frakció rádióaktivitását. A hatóanyag IQo értéke az a koncentráció, amelynél a kifejlődött sejtek rádióaktivitása a kezeletlen kontrollcsoportnál kialakult sejtek radioaktivitásához viszonyítva 50%. 2. MÉM tápközegben (Nippon Flow Laboratories) szuszpendált HEL emberi főtális normál tüdő-fibroblast-sejteket (1 x 104 sejt/ml) tartalmazó szuszpenzió 0,1 -0,1 ml-ét oltottuk be egy 96 mikromélyedést tartalmazó lemez mindegyik mélyedésébe. A tenyészetet ezután 37 'C hőmérsékleten, 5 térfogat% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában, 24 órán át inkubáltuk, majd hozzáadtuk a találmányunk szerinti hatóanyagot tartalmazó MÉM tápközeget, és az így kapott elegyet 72 órán át inkubáltuk. Ezután a tápközeget 1 ftg/ml MTT-t (Dojindo Laboratories) tartalmazó közeggel cseréltük ki, és ehhez 10%-os SDS oldatot (Wako Pure Chemicals) adtunk hozzá. Ezután 590 nm hullámhosszon megmértük az elegy abszorpcióját (Titertec Co.). Az IC» értéket úgy határoztuk meg, hogy az elegy abszorpcióját a kezeletlen kontrollcsoport abszorpciójához hasonlítottuk. A kapott eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be. 2. táblázat Vizsgálandó HL-60 HEL hatóanyag (pg/ml) (|Ag/ml) 10. eljárási példa szerinti eljárással előállított hatóanyag 0,04 20,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
