202927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán monoklonális antitestek előállítására gram-negatív baktériumok szerotípusos lipopoliszacharid-determinánsai ellen
1 HU 202 927 B 2 rogeneity of Antigenic-Side-Chain Lenght in Lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and Salmonella typhimurium LT2-ből származó lipopoliszacharidokban az antigén- oldallánc-hosszak heterogén volta], Eur. J. Biochem. (1980), 107, 145-153. Összeségében ezek az adatok azt jelzik, hogy a 6F11 monoklonális antitest szerológiai fejlagossága közvetlenül a Fisher-féle 2. immun-típusú baktériumok LPS molekulái ellen irányul. Ezen túl, mivel az LPS molekulák fajlagossága az ismétlődő oligoszacharid egységek és/vagy glikozid-kötések szerkezetén alapul (Westphal és munkatársai: Prog. Allergy (1983), 33, 9-39), az adatok azt támasztják alá, hogy a 6F11 monoklonális antitest az oligoszacharid egység bizonyos részeire vagy az ilyen egységek közti kötésekre fajlagos, inkább, mint az LPS központi területe és A lipidje által képviselt szerológiailag rögzített szerkezetekre. A 6F11 monoklonális antitest izotípusát a korábban leírt fajlagossági vizsgálathoz hasonló ELISA vizsgálattal határoztuk meg azzal a különbséggel, hogy a biotinezett kecske anti-humán IgG-t (gamma-láncfajlagos, Tago-gyártmány) vagy biotinezett kecske anti-humán IgM-et (mü-lánc fajlagos, Tago-gyártmány) használtuk a második lépés reagenseként a szélesebb területen reaktív biotinezett kecske anti-humán lg helyett. Mindkét reagenst 1:500 hígításban alkalmaztuk és az antigén-lemez etanollal rögzített Fisher-féle 2. immun-típusú baktériumokat tartalmazott. A 6F11 antitest pozitív reakcióját csak anti-IgM reagenssel figyeltük meg Fisher-féle 2. immun-típusú baktériumokkal, jelezve a monoklonális antitest IgM izotípusát. Akik a szakterületen jártasak, méltányolni tudják, hogy ha ezt a példa szerinti folyamatot több ízben megismételjük és az így nyert LPS-fajlagos monoklonális antitestek izotípusát meghatározzuk, kell, hogy találjunk IgM és IgG izotípusokat egyaránt. F. In vitro aktivitás A 6F11 monoklonális antitest in vitro funkcionmális aktivitását egy opszonofagocitás vizsgálatban vizsgáltuk meg, amely vizsgálat összehasonlította a humán neutrofil sejtek radioaktív baktérium- felvételét komplement jelenlétében, amikor a 6F11 monoklonális antitest jelen volt, vagy nem volt jelen. A radioaktívan jelzett baktériumokat úgy készítettük, hogy 5 ml Pseudomonas minimál tápközeget (Auerard és Snell: „Biochemical Factors in Growth”/ Biokémiai tényezők a növekedésben), 7. fejezet, Manual of Methods for General Bacteriology, szerkesztő: Gerhardt, P. és munkatársai, kiadó: American Society for Microbiology, Washington D.C.. 1981, 79-111 oldal) inokuláltunk 100 pl (1 pCi) H leucinnal (146,5 Ci/mmól, New England Nuclear, Boston, Massachussets) és Fisher- féle 2. immun-típusú P. aeruginosa egy éjszakán át triptonos szója tápközegen nőtt tenyészetének 30 pl-ével. A csövet 37 °C hőmérsékleten rázógépen 4-6 órán át inkubáltuk, ez után a 3H leucin fölöslegét Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldattal, amely még 0,1% zselatint és 5 mmól/1 HEPES-t (pH 7,2) is tartalmazott (HBBS/Gel), történő négyszeri mosással eltávolítottuk. A baktériumokat 950 xg-nél 10 percen át centrifugáltuk minden egyes mosásnál és újra szuszpendáltuk HBBS/Gel-ben 6,67»106/ml végső koncentrációira. A humán neutrofil sejteket Furth és Van Zwet szerint izoláltuk [In Vitro Determination of Phagocytosis and Intracellular Killing by Plymoiphonuclear and Mononuclear Phagocytes (A polimorfmagvú és egymagvú fagociták által végzett fagocitózis és sejten belüli pusztítás in vitro meghatározása), Handbook of Experimental Immunology (1973); 2. kötet, szerkesztő: D.M. Weir, 2. kiadás, kiadó: Blackwell Scientific Publications, Oxford; 36,1-36,24], néhány módosítással. 10 ml heparinozott vérből származó „Buffy coat”-ot rétegeztünk Ficoll-Paque alá és centrifugáltuk. A vörös vérsejt (RBC) szemcséket egyszer mostuk RPMI 1640 tápközeggel és újra szuszpendáltuk egyenlő térfogatú, 37 °C hőmérsékletű PBS- ben. Ebből a szuszpenzióból 3 ml-t adtunk 6 ml 2%-os (37°C hőmérsékletű PBS-ben) dextránhoz, és az így keletkezett keveréket gyengéden, de alaposan összekevertük időről időre. 20 perces, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a vörös vérsejteket hagytuk leülepedni, a felülúszót (amely a neutrofil sejteket tartalmazta) eltávolítottuk és kétszer mostuk PBS-sel 4°C hőmérsékleten. A sejteket még egyszer mostuk 4°C hőmérsékletű HBSS-HEPES-sel (pH 7,2) és újra szuszpendáltuk ugyanebben 5*107 neutrofil sejt/ml koncentrációra. 0,01 mól/l-es EDTA- ban (pH 7,2) újra helyreállított liofilezett nyúlszérum, amely kétszer volt adszorbeálva a hét Fisher-féle immun-típust képviselő élő baktériumokkal [Bjomson, A.B. és Michael, J.G.: Factors in Human Serum Promoting Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa. I. Interaction of opsonins With the Bacterium (A Pseudomonas aeruginosa fagocitózisát elősegítő tényezők a humán szérumban. I. Az opszoninok kölcsönhatása a baktériumokkal), J. Inf Dis. (1974), 130, S119-S125 kiegészítések], szolgált a komplement forrásaként. A meghatározáshoz 300 pl Fisher-féle 2. immun-típusú baktérium-szuszpenziót adtunk 100 pl 6F11 tenyészet felülúszóhoz (amely 1:1 arányban hővel inaktivált FCS-sel volt hígítva) egy 14 ml-es Eppendorfcsőben és rázógépen inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten 30 percen át. Ezt követte előbb 50 pl komplement, majd 50 pl neutrofil-sejt szuszpenzió hozzáadása 30 perces és 45 perces inkubációs időtartamokkal rázógépen 37 °C hőmérsékleten a megfelelő hozzáadás mindegyike után. A neutrofil sejteket ezután kétszer mostuk, a csöveket megtöltve hideg PBS-sel, centrifugálva 5 percen át 100 g- vei és a felülúszót eltávolítva. 250 pl 0,1 n NaOH-t adtunk hozzá, hogy a neutrofil sejtek lizisét elvégezzük, a csövet 15 percig inkubáltuk, Vortex-szel felráztuk és további 15 percig inkubáltuk, ekkor 250 pl-t a cső tartalmából 3 ml szcintillációs folyadékban (Dimilume 30, United Technologies, Packard) szolubilizáltunk és megszámláltuk, Beckman LS 7000 folyadék-szcintillációs számlálót alkalmazva. Az eredményeket a beadott radioaktívan jelzett baktériumok felhasználásának százalékában fejezzük ki. A bevitt radioaktívan jelzett baktériumokhoz társult Cpm-et a kontroll cső tartalmából 250 pl meg5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60i 8
