202925. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 6/23 konszenzus promotert tartalmazó expressziós vektor előállítására
1 HU 202 925 B 2 mentádéval mért a-peptid expresszió a pERVI/23 alapplazmid expressziójának 3-4-szerese volt (2. ábra). Minthogy a két plazmid csak a konszenzussá alakítást előidéző két pontmutációban különbözik egymástól, így az aktivitáskülönbség csak a megnövekedett promoteraktivitás következménye lehet. A pERVI/23 pip2 konszenzus kiónok (a p20429-13 plazmid származékai aktivitása ettől elmaradt, és nem különbözött számottevően az alapplazmidétól. Ennek feltehetően a promoterek interferenciája az oka. 2. példa A pER-VI/23 p2 és a pER-VI/23 pip2 konszenzus kiónok -10 régió végéről induló TGCA szakasz eltávolítása Az 1. példa szerint kialakított konszenzus kiónokat Nsil restrikciós enzimmel emésztjük, majd T4 DNS polimeráz enzimmel kezeljük, amely a ragadós vég 4 túlnyúló nukleotidját leemészti. Ezután T4 ligázzal a plazmid molekulát újból összerázzuk. így kapunk egy olyan konstrukciót, amelyben a p2 promoter -10-es régiója érintetlen marad, azonban a transzkripciós iniciációs pont néhány nukleotiddal downstream tolódik. Vegyszerek és preparátumok Az általánosan használt laboratóriumi vegyszerek alt. minőségű, kereskedelmi forgalomban beszerezhető, REANAL, SIGMA és MERCK készítmények voltak. A [-32P ATP és a-32P]dATP preparátumok (Magyar Izotóp Intézet, Budapest) specifikus aktivitása 100- 150 TBq/mM volt. A használt BamHI, BcmHI, Bell, PstI, FspII restrikciós endonukleázokat az MTA SZBK Biokémiai Intézet Nukleinsav csoportjának munkatársai tisztították a közölt módszerek alapján [Methods in Enzimology (Ed: L. Grossmann, V. Moldave) Vol. 65. pages 89- 180], Az Nsil enzimek a New England Biolabs készítményei voltak. Pankreász RN-áz és lizozim pedig REANAL készítmény volt. A T4 indukált polinukleotid ligáz Murray et al. módszere szerint készült [Murray, N.E., Bruce S.A. and Murray, K: Molecular cloning of the DNA ligase gene from bacteriophage T4. J. Mol. Biol. 132 (1979) 493- 505], Plazmidok PERVI/23 [Lukacsovich, Boros, Venetianen New Regulatory Features of the Promoters of n E. coli r RNAgene. Journal of Bacteriology, 1987,169, 1. kötet 272-277]. Törzsek E. coli K12 JM107 [ATCC47014; Yanisch-Perron, C. és mtsai: Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13 mp 18 and pUC19 vectors. Gene 33 (1985) 103-119]. Az Escherichia coli törzsek növesztésére használt komplett folyadék táptalaj literenként 10 g Bactotryptone-t, 5 g Bacto Yeast extract-ot és 5 g NaCl-ot tartalmazott. Szilárd táptalaj készítéséhez a fenti összetételű médiumot literenként 15 g Bacto-agarral egészítettük ki. A ß-galaktozidäz enzim N-terminális rész (a-peptid) expressziójának becslésére alkalmas indikátor lemezek összetétele literenként: 20 g casaminosav 6 g Na2HP04 3 g KH2PO4 0,5 g NaCl 1 g NH4CI 15 g Bacto-Agár 20 mg X-gal (dimetil-formamidban oldva) 2 mM MgCh 0,1 mM CaCl2 A ß-laktamäz gént kódoló plazmidot tartalmazó sejteket 100 (ig/ml koncentrációban ampicillint tartalmazó táptalajon növesztettük. Plazmid DNS izolálásához a megfelelő plazmidot tartalmazó baktérium törzset 100 pg/ml ampicillint tartalmazó táptalajon tenyésztettük és ODőOOmn 0,7— 0,8 elérésekor 170 pg/ml kloramfenikolt adtunk a kultúrához a plazmid amplifikálására. Preparatív méretekben történő plazmid DNS izoláláskor a Clewell és Helinski által leírt módszerrel clear lizátumot készítettünk [Clewell, D.B. and Helinski, D.R., (1969) Supercoiled circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induced conversion to an open circular RNA form. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 62, 1159- 1166], majd a plazmid DNS-t Sephacryl S1000 (Pharmacia) oszlopon vagy céziumklorid- ethidiumbromid sűrűség gradiensben ultracentrifugálva tisztítottuk. Analitikai méretekben történő plazmid DNS izolálásra (1,0-1,5 ml baktérium kultúrából) a Bimbóin és Doly által kidolgozott és D. Ish-Horowicz által módosított kálium- acetátos módszert alkalmaztuk [Maniatis, T, Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York]. DNS minták hasítása restrikciós endonukleázokkal a New England Biolabs által javasolt rekació körülmények között történt. Ragadós végű DNS fragmentumok összekapcsolásakor a reakcióelegy (30-40 pl) 0,5-1,0 pg DNS-t, 66 mM Tris- HCl-t (pH 7,6) 5 mM MgCh-ot, 5 mM ditiotreitolt, 1 mM ATP- t és 1 egység T4 indukált polinukleotid ligázt tartalmazott. A ligálást 2-3 órán át, 14 °C-on végeztük [Maniatis T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York]. Tompa végű fragmentumok összekapcsolása 30-40 pg/ml DNS, 25 mM Tris-HCl pH 7,4, 5 mM MgCh, 5 mM ditiotreitol, 0,25 mM spermidin, 1 mM ATP, 10 pg/ml BSA (Sigma, Type V) összetételű pufferben történt. A reakcióelegyhez 4-6 egység T4 indukált polinukleotid ligázt adtunk, és 8- 12 órán át 14 'C-on inkubáltunk. DNS minták gélelektroforézisét 0,8-2,0%-os agaróz gélekben (Sigma, Type I), horizontális elektroforézis készülékekben a Helling és mtsai által leírt (1974) mó-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
