202925. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 6/23 konszenzus promotert tartalmazó expressziós vektor előállítására
1 HU 202 925 B 2 A találmány tárgya eljárás a korábbiaknál jobb fehérje hozamot biztosító - ugyanakkor jól szabályozható - expressziós vektorok konstruálására olyan plazmidokból kiindulva, melyek rmB p2 promotert tartalmaznak. Ismeretes, hogy az in vitro DNS rekombináció módszereivel tetszőleges eredetű és információtartalmú gének juttathatók be baktériumsejtekbe. Az, hogy az idegen DNS stabilan fennmaradjon a sejtben, és a benne kódolt információ kifejeződjék, megfelelő hordozó molekulákkal: expressziós (kifejező) vektorokkal biztosítható. Az expressziót egy úgynevezett promoter tartomány iniciálja. Az RNS polimeráz ezt a promotert ismeri fel, és ehhez kötődik a transzkripció iniciálását megelőzően. A gyakorlatban az in vitro DNS rekombináció módszere akkor alkalmazható gazdaságosan, ha a célzott fehérje kielégítő mennyiségben keletkezik, azaz ha mind a transzkripció, mind a transzláció megfelelő intenzitású. A promoterekkel szemben tehát - egyéb szükséges tulajdonságok mellett - alapkövetelmény, hogy „erősek” legyenek, azaz megfelelő intenzitású transzkripciót biztosítsanak. Expressziós vektorokat már igen sokféle promoter felhasználásával készítettek. Ilyenek például a lac, tip, bla, lip, lambda pl promoterek. Ezek közül a gyakorlatban is elterjedten használják a lac (laktóz) operon promotert - elsősorban jól kontrollálható működése miatt - annak ellenére, hogy viszonylag gyengébb promoter. Különböző eredetű ún. hibrid-promotereket tartalmazó expressziós vektorokat ismertet például a 0 067 540 számon közrebocsátott, 82302532.5 számú európai szabadalmi bejelentés. Ezeket az jellemzi, hogy a promoter működés szempontjából fontos -35 és -10 nukleotidok körüli régiók az egyik, illetve a másik promoterből származnak, azaz - más szóval - a két, különböző eredetű promoter rész összekapcsolása a -35 és -10 régiók közötti tartományban történik. Az említett találmányi bejelentés szerint az ilyen promoterek felhasználásával készült expressziós vektorok ipari célokra kiválóan alkalmazhatók, mert működésük jól kontrollálható és ugyanakkor jó intenzitású transzkripciót biztosítanak. Korábbi - 4111/87 alapszámú - találmányi bejelentésünkben ismertetett expressziós vektorok jellemzője, hogy igen erős és jól regulálható (6/23 illetve 6/23[Nsi] jelű) promotert tartalmaznak. A korábbiaknál előnyösebb, igen jól szabályozható és kitűnő génexpressziót biztosító fenti promotereket oly módon sikerült előállítani, hogy egy E. coli riboszomális RNS operon (im operon) p2 promoterét és az E. coli lac operon szabályozó szekvenciáit a -35 és a -10 körüli régiókon kívül, downstream irányban (a gén átírásának irányában) kapcsoljuk össze. Vagyis a riboszomális RNS operon p2 promoterének a -10-es régión kívüli, downstream irányban lévő, GC bázisban gazdag régióját helyettesítjük egy analóg lac operon darabbal. Ezek a promoterek, annak ellenére, hogy két promoter kombinációjával készültek, nem hibrid promoterek, hiszen a promoter működés szempontjából fontos -35 és -10 régiók egyaránt az rmB operon p2 promoteréből származnak. (A fentiek szerint konstruált promoterek a 6/23 jelűek.) További kísérleteink során azt találtuk, hogy ha a fenti promoter rendszert tartalmazó vektorokban közetlenül a -10 régió után, downstream irányban eltávolítjuk a következő 4 bázist: TGCA, a transzkripció intenzitása még megduplázódik. (Az így 'kialakított promoterek jele: 6/23[-Nsi].) A szakirodalomból ismert (Youderian, R et. al: Sequence determinanats of promoter activity, Cell .30:843, 1982; Hawley, D.K. et. al.: Compilation and analyzis of Escherichia coli promoter DNA sequences, NAR 77:2237, 1983) hogy az E. coli promoterek erőssége fokozódik, ha azok -35 illetve -10 régiói minél inkább megegyeznek bizonyos konszenzus szekvenciákkal. Ez a konszenzus szekvencia a -35 régió esetén a TTGACA szekvencia, míg a -10 régiónál a TATAAT szekvencia. Mivel a 4111/87 alapszámú találmányi bejelentésünkben ismertetett promoterek még hibátlan konszenzus szekvenciát tartalmazó promotereknél is erősebbek voltak, sokáig úgy tekintettük, hogy e promotereket tartalmazó vektorcsalád kivétel a fenti empirikus szabály alól, erőssége éppen a konszenzustól való speciális eltérésnek köszönthető. Azonban a legújabb kutatási eredmények alapján egyre inkább bizonyítottá válik az az elmélet, mely szerint a -35 és - 10 régiókon kívüli - kevésbé tisztázott funkciójú - upstream és downstream régiók is befolyásolják a promoterek erősségét. A találmány szerinti expressziós vektorok kialakítása során az volt a célunk, hogy a korábbiaknál erősebb, tehát még jobb fehérje hozamot biztosító, ugyanakkor jól szabályozható expressziós vektorokat készítsünk. Kísérleteink során meglepő módon azt találtuk, hogy a találmány szerinti módon átalakított - azaz a -35 és -10 régiókban a megfelelő konszenzus szekvenciákkal azonos szekvenciájú - 6/23 vagy 6/23 [-Nsi] promotereket tartalmazó vektorokkal a kiindulási vektorokhoz képest 3-4-szer több fehérjét lehet termeltetni. A termelés ilyen mértékű megsokszorozódása teljesen váratlan volt, mert a 4111/87 alapszámú bejelentésünkben ismertetett promoterek már maguk is igen erős promoterek, így nem reméltük, hogy azok erőssége tovább fokozható. A fentiek alapján találmány tárgya tehát eljárás expressziós vektor előállítására, E. coli rmB p2 promotert tartalmazó plazmidokból kiindulva, amely abban áll, hogy a kiindulási plazmid fenti promoterét M13 fágba klónozzuk, az átvitt promoter -35 régióját TTGACA szekvenciává, a -10 régióját TATAAT szekvenciává alakítjuk át irányított mutagenezissel, majd az átalakított promotert pERVI/23 plazmidba vagy valamelyik származékába klónozzuk - 6/23 promotert ezáltal 6/23 konszenzus promoterre cseréljük - végül, kívánt esetben eltávolítjuk a -10 régió végéről induló TGCA szakaszt. A találmány szerinti eljárásnál kiindulási vektorként bármely rmB p2 promotert tartalmazó vektort használhatunk. Különösen előnyös a p20429-10 vagy a p20429-13 plazmid-vektort alkalmazni. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
