202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására
1 HU 202 924 B 2 ilyenek pl. a pUC4k plazmid (NRRL B -15836) és a pUC8 plazmid, amelyek a kereskedelmi forgalomban kaphatók a Bethesda Research Laboratoriestől (BRL), és a pUC9 plazmid, amely szintén rendelkezésre áll a BRL-nél. Mindezek a plazmidok, a pEMBL9+, a pUC4K, a pUC8 és a pUC9, kódolják a ß-galaktozidäz a-fragmenst úgy megalkotva, hogy tartalmazzon egy sokszoros klónozó helyet. Amikor ezeket a plazmidokat olyan gazdasejtekbe transzformáljuk, amelyek korrekt módon egészítik ki az a-ffagmenst, mint pl. abban az esetben, amikor E. coli K 12 RR1AM15 (NRRL B - 15440) a transzformált gazdasejt, a sejtek ß-galaktozidázt fejeznek ki, és ez az indikátor lemezeket, amelyek 5-bróm-4-klór-3-indolil- ß-D-galaktozidäzt (X- gal) és izopropil-tio- ß-galaktozidäzt (IPTG) tartalmaznak, kék színűvé változtatja. Mind az X-gal, mind az IPTG rendelkezésre áll a BRL- nél. Ha azonban a DNS flagmens úgy klónozódik ezeknek a plazmidoknak a sokszoros klónozó helyébe, hogy az a- ffagmens kódoló szekvenciája megszakad, a transzformánsok nem fejeznek ki ß-galaktozidäz aktivitást, és a lemez nem mutatja a kék szint. így ezek az a-ffagmenst kódoló plazmidok kényelmes utat jelentenek a rekombináns plazmidok azonosításához. A pMEBL9+ plazmidokkal transzformált gazdasejteket a 4 A. példa módszerével összhangban kezeljük, és ~5 pg pEMBL9+ DNS-t izolálunk. A pMEBL9+ plazmid DNS-t azután BamHl és Pstl restrikciós enzimekkel kezeljük, lényegében a 4 B. példa szerinti eljárással összhangban. Az emésztett DNS-t nem tisztítjuk gélelektroforézissel. E helyett a BamHl-Pstlemésztett pEMBL9+ plazmid DNS-t újra szuszpendáljuk 5 pl TE pufferban. D. Ligálás és E. coli K 12 RRlAM15lpKC407 megalkotása Mintegy 1 pg 4 C. példa szerint előállított BamHl- Pstl emésztett pEMBL9+ DNS-t és 1 pg—1,8 kb-s, 4 B. példa szerint előállított BamHl-Pstl restrikciós ffagmenst ligálunk 20 pl l»ligáz pufferban (5 mmól/1 trisz- HC1, pH-7,8; 10 mmól/1 MgCh; 20 mmól/1 ditiotreitol; és 1 mmól/1 ATP) 400 egység T4 DNS ligázzal (New England Biolabs) 16 órán át 16 °C hőmérsékleten. Areakciót olyan módon fejezzük be, hogy 70 °C hőmérsékleten 10 percen át inkubáljuk. Jégen való hűtés után az így létrejött ligáit DNS-t használjuk E. coli K 12 RR1AM15(NRRLB -15440) transzformálására Maniatis és munkatársai módszere szerint [Molecular Cloning (molekuláris klónozás), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)], amely irodalmi helyet referenciaként építünk be ide. A kívánt transzformánsok azonosságát olyan módon bizonyíthatjuk, hogy a sejteket TY agar lemezekre, amelyek 1 mmól/1 IPTG-t, 20 pg/ml X-galt és 50 pg/ml ampicillint is tartalmaznak, szélesztjük, és elvégezzük a transzformánsok plazmid DNS-ének restrikciós elemzését is. A ß- galaktozidáz-negatív transzformánsokat, amelyek a pKC407 plazmid DNS-t magukban foglalják, tenyésztjük és plazmidjukat izoláljuk, lényegében a 4 A. példa szerinti eljárással összhangban. A pKC407 plazmid DNS-t, amely tartalmazza az eritromicin rezisztencia átadó gént, jelezzük és a jelen találmány szerinti módszerben alkalmazzuk. 5. példa A pKC407 plazmid jelzése Ez a példa olyan eljárást ír le, amelynek révén egy kettős szálú DNS molekula egyik szálát először eltávolítjuk, majd helyettesítjük. Ezt a folyamatot gyakran hívják „nick” (hézag) transzlációnak. Mivel a folyamatot dezoxicitidin 5’- [a-32P] trifoszfát [32P-dCTP) jelenlétében hajtjuk végre, és mivel a DNS molekula mindegyik szála tartalmaz dezoxicitidil gyököket, a helyettesítési reakció radioaktív foszfort, ^P-t épít be a DNS-be. Ez a radioaktivitás segít a jelen találmány azonosítási lépésében, amely az a lépés, amelyben a genetikai könyvtárnak azokat a vektorait, amelyek egy antibiotikum rezisztencia átadó DNS szegmenshez hibridizálódnak, azonosítjuk. 5 pg pKC407 plazmid DNS-t emésztünk BamHl és Pstl restrikciós enzimekkel 200 pl l'BamHl pufferban, és az így létrejött ~1,8 kb-s BamHl-Pstl restrikciós ffagmenst izoláljuk, lényegileg a 4 B. példa szerinti módszerrel összhangban. Mintegy 2,5 pg kívánt, -1,8 kb-s restrikciós ffagmenst izolálunk és szuszpendálunk 5 pl TE pufferban. A nick-transzlációt olyan módon hajtjuk végre, hogy először feloldunk 0,1 pg, pKC407 plazmidból származó ~1,8 kb- s BamHl-Pstl restrikciós ffagmenst a következő keverékben: 5 pg 10*nick-transzlációs puffer (0,5 mól/1 trisz-HCl, pH-7,8; 0,05 mól/1 MgCb; és 0,1 mól/1 ß- merkapto-etanol); 5-5 pl 300 pmól/l-es dezoxiguanidin trifoszfát (dGTP), dezoxiadenozin trifoszfát (dATP) és timidin trifoszfát (TTP); 2 pl (20 pCi) 32-dCTP [Amersham (2636 S. Clearbrook Dr., Arlington Heights, Illinois 60005)], és 48 pl H2O. A reakciót úgy indítjuk el, hogy 1 mg/ml-es szarvasmarha pankreász- eredetű, ribonukleáz-mentes dezoxiribonukleázt (DNÁ-z) [Miles Laboratories (P.O.Box 2000, Elkhardt, Indiana 46515)] 10 000- szeresére hígítunk, majd ebből a hígított DNA-z-ból azonnal hozzáadunk 1 pl-t a pKC407 DNS-t tartalmazó keverékbe. A reakciókeveréket 15 “C hőmérsékleten inkubáljuk két percig, majd 1 pl (10 egység) E. coli DNS polimeráz I-et (New England Biolabs) adunk a reakciókeverékhez, amelyet azután 15 °C hőmérsékleten inkubálunk két órán át. A reakciót 50 pl 0,1 mól/l-es EDTA hozzáadásával és 65 °C hőmérsékleten végzett 10 perces hőkezeléssel állítjuk le. A reakciókeveréket ezután Sephadex G-100 oszlopon (Sigma Chemical Co., P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63178) engedjük át egy 10 ml-es eldobható pipettában, 10 mmől/1 trisz-HCl-ből (pH-7,5); 1 mmól/1 EDTA-ból; 0,1 mól/1 NaCl-ből; és 0,01% SDS-ből összeállított elúciós pufferrel. A pKC407 plazmid DNS-t Geiger számlálóval figyeljük^ hogyan halad át az oszlopon. A reakció tipikusan 107 beütés/perc) g DNS-t épít be. A jelzett DNS-t - 70 °C hőmérsékleten tároljuk felhasználásig. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15
