202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 éppúgy e polipeptid mindenfajta módosulata is a találmány oltalmi körébe tartozik. A módosítások közé tartozik például a molekula megrövidítése az N- vagy C-terminális végén vagy aminosavak kicserélése másik csoportra úgy, hogy a molekula aktivitása lényegesen ne változzék. A találmány nemcsak azokra a génszekvenciákra vonatkozik, amelyek specifikusan az adott HLZ-t kódolják, hanem éppúgy azokra a módosulatokra is, amelyek rutinszerűen előállíthatók mutáció, lebontás, transzpozíció vagy addíció segítségével. Minden olyan szekvencia, amely a leírt HLZ-t kódolja (azaz amely a megfeleld és ismert biológiai aktivitás-spektrummal rendelkezik) és azok, amelyek a bemutatott szekvenciával összehasonlítva degeneráltak, szintén a találmány oltalmi körébe tartozik; az e területen működű szakemberek el tudják végezni a kódoló szakaszok DNS szekvenciáinak a módosítását. Hasonlóan minden olyan szekvencia, amely a HLZ aktivitás-spektrumával rendelkező valamely polipeptidet kódol és azok is, amelyek a bemutatott szekvenciákkal (vagy ezekből részekkel) szigorúan meghatározott feltételek mellett hibridizálnak (például olyan feltételek mellett, amelyek több mint 85%-os, előnyösen több mint 90%-os homológia esetén szelektálnak), a találmányhoz tartoznak. Hogy a találmány szerinti anyagot gyógyszerként alkalmazhassuk, ismert módon állíthatjuk össze a receptúrát, mely szerint a találmány szerinti polipeptid egyedül vagy más komponensekkel együtt, így különböző antibiotikumokkal (tetraciklin, bacitracin), enzimekkel (alfa-amiláz, papain) vagy vitaminokkal kiegészítve kerül alkalmazásra. A következő példákban részleteiben írjuk le a találmányt, azonban a találmány oltalmi körét nem korlátozzuk e példákra. Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákát. Az 1. ábrán a primer-extenziós kísérlet eredményét mutatjuk be, amelyben az EÍ-ON19 és az EÍ-ON20 oligonukleotidok a primerek és az U-937 sejtvonalból izolált RNS a templát. A 2. ábra a dot-blot-hibridizálás eredményét ábrázolja. A 3/a ábra a HLZ-cDNS (HL14-1 klón) szerkezetét és a 3/b ábra a HLZ-cDNS nukleotid szekvenciája meghatározásának stratégiáját mutatja be. A 4/a ábra a HLZ-cDNS (HL14-1 klón) DNS szekvenciáját és a 4/b ábra a HL14-1 klónből származó HLZ-cDNS restrikciós térképét ábrázolja. Az 5. ábra a HLZ-re leközölt aminosav szekvencia (felső sor) és a HL 14-1 klón cDNS-éből levezetett aminosav szekvencia (alsó sor) összehasonlítását mutatja be. A 6. ábra a pEAS102 sokmásolatú hibrid-vektort ábrázolja (szerkesztését és alkalmazását lásd fentebb). A 7. ábrán bemutatjuk, hogy hogyan kapcsoljuk össze az ADHI promote« az a-faktor vezérszekvenciával, valamint a pWS215D további szerkesztését, amelynél a HLZ gént a megfelelő irányítottsággal kapcsoljuk össze az a-faktor vezérszekvenciával. A 8. ábra a HindlH-linker bevezetését mutatja be (8.b példa), valamint a Sáli- és Hindül-linker beépítését (9.b példa; eredmény: a pWS208D szerkezet); a linkerek beépítésének az a célja, hogy a HLZ gént a megfelelő irányítottsággal építhetssük be az a-faktor vezérszekvenciához, illetve az a-faktor promoterhez, illetve -terminátorhoz képest. A 9. ábra az EBI124 és EBI234 szintetikus oligonukleotidokkal megvalósított in vitro mutációkat ábrázolja, amelykenek az a céljuk, hogy pontos átmenetet létesíthessünk az a- faktor vezérszekvencia és a HLZ gén között. A 10. ábrán a pWS235D szerkesztését mutatjuk be. Ebben a HLZ gén egzakt 3’ vége a megfelelő irányítottsággal van beépítve az ADHII terminátor elé. A 11. ábrán bemutatjuk, hogy hogyan távolítjuk el a HLZ gén és az ADHII terminátor között lévő BamHI helyet (pWS257D) és bemutatjuk az expressziós kazetta végleges szerkezetét is (pWS290D). A 12. ábra azt mutatja, hogy a pUC13 plazmid paF származékából származó a-faktor gén hogyan klónozzuk be - mint EcoRI fragmentumot - a V2 vektorba, amely pUCl8 származék (szerkesztését lásd a 9.d példában; pWS230D). A 13. ábra megvilágítja azt a módot, hogy hogyan kötjük össze a HLZ gént az a-faktor promoterrel és -terminátorral a megfelelő irányítottságggal (pWS231D). A 14/a és 14/b ábrákon azt mutatjuk be, hogy hogyan távolítjuk el az a-faktor gén 5’ vége közelében lévő PstI helyet (pWS294D); bemutatjuk továbbá az a-faktor promoter irányítása alatt álló pWS296D expressziós kazetta végleges formájának elkészítését, amikor is a 9. ábrában ábrázolt A2 mutáns PstI fragmentumot a pWS294D egyetlen PstI helyére kapcsoljuk be ligáz reakcióval. A példákban használt rövidítések: HLZ humán lizozim RPMI Roswell Park Memorial Institute Tris.HCl trisz-(hidroximetil)-aminometán, pH-ja HCl-dal beállítva EDTA etilén-diamin-tetraecetsav DEP dietil-pirokarbonát SDS nátrium-dodecil-szulfát NaAC nátrium-acetát BSA marha szérum albumin DTT 1,4-ditiotreitol (1,4-dimerkapto-2,3-büfándiol) PCI fenohkloroform: izoamil-alkohol (15:24:1) ß-NAD ß-nikotinamid-adenin-dinukleotid ' sscDNS szimpla szálú cDNS E.coli Escherichia coli SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M nátrium-citrát tartalmú oldat, pH-7-re beállítva 10 n NaOH-val Denhardt oldat 0,1% Ficoll, 0,1% polivinil-pirrolidon és 0,1% BSA tartalmú oldat TBE 0,082 M trisz, 0,082 M bórsav és 0,002 M EDTA tartalmú oldat; pH-8. 1. példa HLZ aktivitás meghatározása U-937 sejtvonalból Ismeretes, hogy az U-937 emberi hematopopetikus 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
