202921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumor nekrózis faktort kódoló DNS, továbbá annak alkalmazásával a fenti faktornak megfelelő polipeptid, és hatóanyagként egy fenti polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 921 B 2 fragmensnek nevezzük. A Hpal-EcoRI-fragmenst egy kémiailag szintetizált, 5 ’ -CCCGG ATCCGGG 3 ’-GGGCCTAGGCCC szekvenciája oligodezoxiribonukleotiddal kapcsoljuk össze. Ezután a kapcsolt DNS-fragmenst BamHI restrikciós endonukleázzal emésztjük. A kapott, kb. 3600 bázispárból álló DNS-fragmenst, amely mindkét végén BamHI kohéziós terminálissal rendelkezik, a továbbiakban phoS promoter-BamHI*Tetr fragmensnek nevezzük. A HTNF-Tetr*BamHI-fragmenst a phoS promoter- B amHI*Tetr-fragmenssel összekapcsolva foszfát-kötő proteinnel fuzionált humán TNF polipeptid termelésére képes expressziós plazmidot kapunk, melyet pHTSl 15-nek nevezünk. A fenti expressziós plazmidot a fent ismertetett eljárással E. coli HB101 sejtekbe visszük be. A transzformánsok egyikét (HB101/pHTS115) 5 ml 0,64 mmól/1 kálium-dihidrogén-foszfáttal kiegészített TG-táptalajban (összetétel: 120 mmól/1 koncentrációjú, 0,2% glükózt, 80 mmól/1 nátrium-kloridot, 20 mmól/1 kálium-kloridot, 20 mmól/1 ammónium- kloridot, 3 mmól/1 nátrium-szulfátot, 1 nmól/1 magnéziumkloridot, 0,2 mmól/1 kalcium-kloridot, 200 mmól/1 ferri-kloridot, 20 mg/1 leucint, 20 mg/1 prolim és 10 mg/1 Bi-vitamint tartalmazó Tris-HCl-puffer, pH 7,4), 37 “C-on, rázatás közben 20 órán át tenyésztjük. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, 2 ml 0,064 mmól/1 kálium-dihidrogén-foszfáttal kiegészített TG- táptalajban újraszuszpendáljuk és 37 °C-on 6 órán át tenyésztjük. A sejteket lecentrifugáljuk, 1 ml, 30 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,2) mossuk, majd 0,2 ml 33 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 7,2) újraszuszpendáljuk, és azonos térfogatú, 0,1 mmól/1 EDTA-t és 40% szacharózt tartalmazó 33 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-puffeirel (pH 7,2) elegyítjük. Az elegyet 37 “C-on 10 percen át inkubáljuk, majd a sejteket összegyűjtjük, 0,4 ml hideg, 0,5 mmól/1 koncentrációjú magnézium-klorid-oldatban újraszuszpendáljuk és jeges vizes fürdőn 10 percen át állni hagyjuk, a szuszpenziót időnként rázogatjuk. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítva tiszta extraktumot kapunk, melyet a továbbiakban periplazmás extraktumnak nevezünk. A periplazmás extraktum citotoxikus aktivitása 1,34»105 egység (L-929)/ml. A citotoxikus aktivitással rendelkező polipeptid móltömege nátrium-dodecilszulfát (SDS)-poliakrilamid gélben (12,5%) elektroforézissel meghatározva 19000, ami azt jelenti, hogy az előállított polipeptid egy fuzionált protein. (4) Expresszió phoS promoter szabályozás mellett A szignál-peptiddel és a foszfát-kötő protein N-terminális részével fuzionált humán TNF polipeptid, továbbá a prekurzorának egy részét is tartalmazó biológiailag aktív humán TNF polipeptid termelésére képes, és azt a gazdasejt periplazmájába ürítő pHTS37 expressziós plazmid előállítását az 5. ábrával szemléltetjük. A pHTNF13 rekombináns plazmid DNS-t PstI restrikciós endonukleázzal emésztve kivágjuk a kb. 1200 bázispárból álló, humán TNF cDNS-t magában foglaló DNS-fragmenseket. A kapott DNS- fragmenst Bbel restrikciós endonukleázzal tovább emésztve egy kb. 900 bázispárból álló DNS-fragmenst kapunk, melyet a továbbiakban Bbel-Pstl-fragmensnek nevezünk. 6 mikrogramm Bbel-Pstl-fragmenst 80 mikroliter, 12 mmól/1 kalcium-kloridot, 12 mmól/1 magnéziumkloridot, 0,2 mmól/1 nátrium-kloridot, 1 mmól/1 EDTA-t és 0,02 egység Bal 31 exonukleázt tartalmazó 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl- pufferben (pH 8,0) oldunk, és 30 °C-on 30 percen át inkubálva a DNS- ffagmens mindkét végéről közel 50-150 bázispárt lehasítunk. A fragmensek végeit ezután 37 “C-on 60 percen át 10 egység E. coli DNS-polimeráz I-gyel (nagy fragmens) inkubálva 0,1 mmól/1 dTGP, 0,1 mmól/1 dGTP, 0,1 mmól/1 dATP, 0,1 mmól/1 dCTP, és 0,1 mmól/1 dTTP, továbbá 50 mikrogramm/ml marha szérumalbumin jelenlétében kijavítjuk. A javított DNS- fragmenst EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztjük, és a kapott, közel 750 bázispárt tartalmazó DNS- fragmenst, amely tompa és egy EcoRI kohéziós véggel rendelkezik - továbbiakban Bal 31-EcoRI-fragmensnek nevezzük -, izoláljuk, a hozam kb. 3 mikrogramm. A Bal 31-EcoRI-fragmenst a közel 4000 bázispárból álló Hpal- EcoRI-fragmenssel összekapcsolva - az utóbbit a (3) pontban pSN5182-ből állítottunk elő - olyan expressziós plazmidot kapunk, amely phoS promoter régiót, Shine-Dalgamo-szekvenciát, a szignálpeptidet és egy foszfát-kötő protein N-terminális részét kódoló DNS-szekvenciát, és a biológiailag aktív humán TNF polipeptidet és prekurzor polipeptidjének egy részét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. Az expressziós plazmidot pHTS37-nek nevezzük, és E. coli HB101 sejtekbe visszük be, a kapott transzformánst HB101/pHTS37-nek nevezzük. A HB101/pHTS37 transzformáns tenyésztését és a periplazmás extraktum előállítását a (3) pontban leírtak szerint végezzük. A kapott periplazmás extraktum citotoxikus aktivitása 4,93*10* egység (L-929)/ml. Az extraktumot SDS-poliakrilamid (12,5%) gélelektroforézisnek vetjük alá. Az elektroforézist 35 V feszültség mellett 12 órán át folytatjuk, 0,1% SDS-t tartalmazó Tris-glicin-puffert (pH 8,3) használva. A proteint Coomassie brilliant blue-val festjük meg. A 22000, illetve 16500 móltömegnek megfelelő helyzetben két olyan protein-sáv található, amely az E. coli HB101 extraktumában nem észlelhető. Egy másik géllemezt 2 mm-es csíkokra vágunk, és minden egyes gélszeletet 1 ml, 1% magzati marhaszérumot tartalmazó Eagle-féle minimáltáptalajban egy éjszakán át 4 “C- on rázatunk, a protein eluálása céljából. Minden egyes eluátum citotoxikus aktivitását mérjük, célsejtként egér L- 929 sejteket használunk. Vizsgálati eredményeink szerint a Comassie brilliant blue-val festett le5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 24
