202920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén rekombináns immun interferon fragmensek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 920 B 2 Általánosabban találmányunk minden olyan rekombináns interferon fragmensre kiterjed, amelyben a C- végcsoporton a teljes hosszúságú érett rekombináns humán immun interferonhoz viszonyítva 6-11 aminosav törölve van. Találmányunk továbbá a fenti fragmensek összes olyan módosítására vagy allelikus változatára kiterjed, amely a fragmensek vagy módosulatok vagy allelikus változatok a teljes hosszúságú érett rekombináns humán immun interferonnál erősebb biológiai aktivitással rendelkeznek. Találmányunk tárgya továbbá rekombináns immun interferon ffagmenst kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó és kifejezési kontroll szekvenciához működőképesen csatlakozó replikálható mikrobás expressziós hordozók, továbbá a fent meghatározott kifejezési hordozókkal transzformált mikroorganizmusok előállítására. Találmányunk továbbá egy vagy több rekombináns immun interferon fragmenst és fiziológiai szempontból alkalmas hordozóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására vonatkozik. Találmányunk tárgya továbbá eljárás rekombináns immun interferon fragmensek előállítására, rekombináns DNS technológia felhasználásával. Találmányunk tárgya továbbá eljárás a fent meghatározott replikálható mikrobás kifejezési expressziós transzformált mikroorganizmusok előállítására. Találmányunk továbbá a fent meghatározott rekombináns immun interferon fragmenseket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására vonatkozik. A találmányunk szerint előállított fent meghatározott interferon fragmensek és azokat tartalmazó gyógyászati készítmények különböző betegségek és betegségekkel összefüggő állapotok kezelésére alkalmazhatók. Találmányunk jobb megértése céljából az alábbi találmányi leírásra és kísérő rajzokra hivatkozunk. Az alkalmazott rövidítések és szimbólumok jelentése a következő: B, E, H, S, Sa, Sc, X, Xb a restrikciós endonukleáz BamHI, EcoRI, HindlII, Sphl, Sáli, Shol, illetve Xbal helyeit jelöli. A 2., 4. és 6-9. ábrán a pontozott téglalap;.;.'.v| a bla, lacl és neo gének promotorjait jelenti; a vízszintes vonalakat tartalmazó téglalap a bla, cat, neo és lacl gének riboszómás kötődési helyeit jelöli; a függőleges vonalazású téglalap ||l||Hl;|il a to és TI terminátorokat ábrázolja; a | téglalap a pN25*/0 szabályozható promotor/operátor elemet jelenti; a pöttyözött téglalap |v°°/J a RBSH.Sphl riboszómás kötődési helyét jelöli; a nyíl —> a fenti riboszómás kötődési hely ellenőrzése alatt levő kódoló tartományt jelöli; a kétirányú nyíl trr> a DNS replikádéhoz (repl.) szükséges tartományt jelenti; a ceruzaszerű nyíl a dihidrofolát reduktáz (dhfr) klóramfenikol acetil transzferáz (cat), beta-laktamáz (bla), lac represszor (lacl), neomicin-foszfotranszferáz (neo) és interferon-y (IFNy) kódoló tartományait jelöli. 1. ábra Az N-végcsoporton a Cys-Tyr-Cys-szekvenciát és azt kódoló nukleotid szekvenciát nem tartalmazó érett rekombináns humán immun interferon (rIFN-y) aminosav-szekvenciája. A rekombináns immun interferon fragmensek felépítéséhez felhasznált HinfI helyett aláhúztuk. A prokarióta transzlációs start szignálból leszármaztatott N-terminális metionint zárójelbe tettük. 2. ábra A pDS8/RBSII,SphI plazmid sematikus ábrája. 3. ábra A pDS8/RBSII,SphI plazmid Xhol/Xbal fragmensének nukleotid szekvenciája, amely a Pn25*/0 szabályozható promotor/operátor elemet, RBSII,SphI riboszómás kötődési helyet, dhfr gént, to terminátort, cat gént és TI terminátort tartalmaz. A 2. ábrán feltüntetett restrikciós endonukleáz helyek fölé vízszintes vonalat húztunk és a dihidrofolát reduktáz polipeptidet kódoló RBSII.Sphl ellenőrzése alatt levő tartományt aláhúztuk. Ezenkívül a pDS8/RBSII,SphI-nek a pBR322 egységét sematikusan ábrázoljuk, ahol is a megadott számok a pBR322 nukleotid szekvenciájára vonatkoznak [J.G. Sutcliffe, Cold Spring Harbor, Symp. Quant. Biol. 43, 77-90. oldal (1979)]. 4. ábra A pDMI.l plazmid sematikus ábrája. 5. ábra A pDMI.l plazmid DNS szekvenciája. A 4. ábrán feltüntetett endonukleáz helyek fölé vízszintes vonalat húztunk, míg a neomicin foszfotranszferáz és lac represszor (lacl) kódoló tartományait aláhúztuk. 6. ábra Érett rekombináns humán immun interferon (rIFN-y) gént tartalmazó 1 fragmens felépítésének és izolálásának vázlatos ábrázolása, amelynek során a 146 aminosavból álló, N-terminális szekvenciaként Cys-Tyr-Cyst tartalmazó rekombináns humán interferont kódoló gént tartalmazó pRC23/IFI-900 plazmidból indulunk ki. 7. ábra 1 fragmens integrálása pDS8/RBSII,SphI-be, amelynek révén pGLS keletkezik. A pGLS sematikus ábráján levő (Se) azt a helyzetet jelöli, ahol az 1 fragmens a pDS8/RBSII,SphI Seal hasítási helyéhez kapcsolódik. 8. ábra Három különböző rekombináns immun interferon fragmens C-végcsoportját kódoló EcoRI-Hindlü-fragmensek F(-6), F(-8) és F(-ll felépítésének sematikus ábrázolása, a pGLS Hinfl-fragmense és a Hinfl-Hindlll A(-6), A(-8) és A(-ll) adapterek felhasználásával. Az EcoRI-Hindin F(-7), F(-9) és F(-10) fragmenseket 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
