202920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén rekombináns immun interferon fragmensek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 920 B 2 gálunk az IFN-y-gén egyetlen HinfI felismerő helyén (8. ábra) és ily módon végül az F(-6), F(-7), F(-8), F(-9), F(-10) és F(-ll) ffagmenseket kapjuk. Ezeket a fragmenseket pDS8/RBSII,SphI-be ligáivá pIFN-y(-6), pIFN-y(-7), pIFN-y(-8), pIFN-y(-9), pIFN-y(-10) és pIFN-y(-ll) plazmidokat kapjuk (9. ábra). B. F(-6), F(-7), F(-8), F(-9), F(-10) és F(-ll) fragmensek készítése 3 pmól pGLS-plazmidot 15 egység HinfI segítségével (8. ábra) „magpufferben” 37 °C-on 50 pl térfogatban egy órán át emésztünk. Az emésztés után a restrikciűs enzimet 7 percen át 65 cC-on inaktiváljuk, majd a mintát a korábban leírt módon fenollal extraháljuk, éterrel kezeljük, kicsapjuk és szárítjuk. A pelletet 50 pl ligáz-pufferben oldjuk. Az A(-6), A(-7), A(-8), A(-9), A(-10) és A (-11) adaptereket tartalmazó oligonukleotideket a 2B. példában leírt módon szintetizáljuk. lOOpmól foszforilezett adaptert párhuzamosan 10 pl HinfI által emésztett pGLS plazmidhoz adunk. A ligáz puffer és 1 egység T4-DNS-ligáz hozzáadása után a ligálást 25 pl össztérfogatban, 22 °C-on 12 órán át végezzük. A reakciókat oly módon állítjuk le, hogy a mintákat 7 percen át 65 °C-on melegítjük. Etanolos lecsapás után a DNS pelleteket „magpufferben” újraszuszpendáljuk és 15 egység EcoRI és 20 egység Hindül segítségével 2 órán át 37 ‘C-on, 50 pl térfogatban inkubáljuk. Hővel történő inaktiválás, fenolos extrackió, éteres kezelés és etanolos lecsapás után a mintákat 10 pl, gélt tartalmazó pufferben oldjuk és 6 % poliakrilamid gélen elektroforézisnek vetjük alá. A DNS mintákat 300 nm UV-fény alatt tesszük láthatóvá. Az IFN-y-géneket tartalmazó sávokat a gélből kivágjuk és a korábbiakban leírt módon NA45 membránon elektroforézisnek vetjük alá. Marker DNS-nek HaelII által emésztett 0X-DNS fágot alkalmazunk. A DNS eluálását a korábbiakban leírt módon végezzük el és jelölésük: F(-6), F(-7), F(-8), F(-9), F(-10) és F(-ll). C. pDS8/RBSII,Sphl plazmid hasítása A 9. ábrán jelzett módon pDS8/RBSII,SphI plazmidot 10 egység EcoRI és 10 egység Hindin segítségével 1 órán át, 37 °C-on, 50 pl össztérfogatban emésztünk. Az enzim hővel végzett inaktiválása és etanolos lecsapás után a DNS pelletet 10 pl, gélt tartalmazó pufferben oldjuk. 1 % agaróz gélben végzett elektroforézis után a to terminátort, cat gént, TI terminátort, replikációs eredetet, bla gént és Pn25*/o promotort tartalmazó HindlII/EcoRI ffagmenst a gélből kivágjuk és a leírt módon eluáljuk. A végső DNS pelletet 50 pl ligáz pufferben oldjuk. D. pIFN-y(-6), pIFN-yí-7), pIFN-y(-8), pIFN-y(-9), pIFN-y(-10) és plFN-yf-ll) plazmidok összeállítása 10 pl vektor fragmenst és a 3B. példa szerint kapott mindegyik izolált F(-6), F(-7), F(-8), F(-9), F(-10) és F(-ll) fragmens fele mennyiségét párhuzamosan 20 pl térfogatban, 22 'C-on, 3 órán át 1 egység T4-ligázzal Egálunk. Ezzel párhuzamosan kontroll ligálást végzünk, beillesztett DNS nélkül. A ligálást oly módon állítjuk le, hogy a mintákat 7 percen át 65 ‘C-on hevítjük. A transzformációt a Morrison által leírt, fent hivatkozott módon végezzük el, a pDMI.l. plazmidot befogadó E.coli M15 felhasználásával. A sejteket 100 pl/ml ampicillint és 25 pg/ml kanamicint tartalmazó LB-agar lemezeken a fentiekben leírt módon szélesztjük. A lemezeket egy éjjelen át 37 ‘C-on inkubáljuk. Mint azt vártuk, a kontroll ligálások során nem kapunk transzformánsokat. A DNS vektort + ffagmenseket tartalmazó ligálások kb. 500-1000 telepet adnak. Az egyes telepeket fogpiszkálóval felvesszük és a fent ismertetett módon 10 ml LB-táptalajban tenyésztjük. A plazmid DNS-t Bimbóim és tsai fent ismertett módszerével extraháljuk. A végső pelleteket 200 pl TE- pufferben oldjuk. 4 pl izolált DNS-t 2 egység EcoRI- val és 2 egység HindlII-mal emésztünk. Az összes megvizsgált klón a várt, mintegy 450 bp nagyságnak megfelelő fragmenst szabadít fel. A F(-6) fragmenst tartalmazó plazmidokat pIFN-y (-6)-nak nevezzük, míg a F(-7), F(-8), F(-9), F(-10) és F(-ll) fragmenseket befogadó plazmidok neve pIFN-y (-7), pIFN-y(-8), pIFN-y(-9), pIFN-y(-10), illetve pIFN-y(-ll). Ezek a plazmidok a IFN-y(-6), IFN-y(-7), IFN-y(-8), IFN-7(-9), IFN-y(-10), illetve IFN-y(-ll) (10. ábra) rekombináns immun interferon fragmenseket kódoló gének kifejező vektorai. 4. példa IFN-y gének kifejezése E.coli-ban A. Elv Annak igazolása céljából, hogy a módosított IFN-y gének az E.coli-ban nagy mennyiségben fejeződnek ki, e géneket pIFN-y(-6), pIFN-y(-7), pIFN-y(-8), pIFN-y(-9), pIFN-y(-10) vagy pIFN-y(-ll) által módosított E.coli M15 (pDMI.l)-ben fejezzük ki és az összes sejtfehérjét SDS- poliakrilamid gélelektroforézissel megelemezzük. B. IFN-y-fehérjék termelése E.coli-ban PDMI.l plazmidot tartalmazó E.coli M15 sejteket pIFN-y(-6), pIFN-y(-7), pIFN-y(-8), pIFN-y(-9), pIFN-y (-10) vagy pIFN-y(-ll) segítségével transzfoimálunk, míg párhuzamosan kontrollként pGLS-t alkalmazunk. A transzformátumokat 100 pg/ml ampicillint és 25pg/ml kanamicint tartalmazó LB-táptalajon tenyésztjük. A tenyészeteket 600 nm-nél kb. 0,7 optikai sűrűség mellett IPTG segítségével indukáljuk (végső koncentráció 1 mmól). További 6 órás inkubálás után a sejteket oentrifugálással összegyűjtjük. C. E.coli-ban termelt fehérjék vizuális meghatározása (láthatóvá tétele) 40 pl térfogatú tenyészetből vett sejteket 3 % SDS- t, 3 % ß-merkapto-etanolt, 20 % glicerint és 125 mM tris-HCl-t tartalmazó pufferben (pH 6,8) újraszuszpendálunk. A mintákat 5 percen át forraljuk, jéggel lehűtjük, 12 000 g mellett 30 másodpercen át centrifugáljuk és SDS-poliakrilamid gélen [12,5 % akrilamid, akrilamid(bisz-akrilamid arány 30)0,8] Laemmli módszeré5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
