202918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás savas ureáz előállítására
1 HU 202 918 B 2 bontsa és eltávolítsa a karbamidot (lásd a 104 155/1989 számon közzétett japán szabadalmi leírást), így az ilyen termékek minőségének javítására használható. Másrészt ez az ureáz igen hatékony reagens karbamid meghatározáshoz vér- és vizeletmintákból a klinikai laboratóriumi vizsgálatok során, valamint alkoholos italokban (lásd a 104 199/1989. számon közzétett japán szabadalmi leírást), valamint egyéb felhasználási célokra. Például a szakéban a karbamid meghatározást igen nagy pontossággal végezhetjük, ha a karbamidot evvel az enzimmel bontjuk el, és az indofenol módszert használjuk. Az ábrák rövid ismertetése Az 1., 2., 3. és 4. ábrán a pH és hőmérséklet, valamint az 1. példában előállított ureáz enzimes aktivitásának összefüggését tüntetjük fel. Az 1. ábrán, amely a pH aktivitásgörbét mutatja 37°C hőmérsékleten, a », az o és az x sorrendben a 0,1 mólos citrátpufferben, 0,1 mólos acetátpufferben és a 0,1 mólos veronál-ecetsav-HCl-pufferben végzett meghatározás eredményét tünteti fel. A 2. ábra, amely az enzim pH-stabilitását mutatja, a maradék aktivitást ábrázolja 30 perc után, 37 °-C hőmérsékleten. A 3. ábra a hőmérséklet-aktivitás görbét mutatja pH-4-es értéknél 0,1 mólos citrátpufferben. A 4. ábra, amely az enzim hőmérséklet-stabilitását mutatja, a maradék aktivitást tünteti fel 30 perc után különféle hőmérsékleteken, o jelenti a pH -4-et és a • pH 6-ot 0,1 mólos citrátpufferben. Az 5-8., 9-12., 13-16., 17-20., 21-24., 25-29. és 29-32. ábra a pH és a hőmérséklet, valamint sorrendben a 2., 3., 4., 5., 6., 7. és 8. példa szerint előállított ureáz enzimes aktivitása közötti összefüggést mutatja. Az 5-32. ábrán látható kísérleteket 0,1 mólos citrátpufferben végeztük. Kivételt képeznek ezalól a pH- stabilitás vizsgálatok. A következőkben néhány példával illusztráljuk a találmányt. 1. Példa A kereskedelmi forgalomban kapható GAM félfluid tápközegben tenyésztett (a tápközeg a Nissui Seiyaku Co., Ltd., Japán terméke) Lactobacillus reuteri Rt-5-ot (IFO 14 631, FERM BP-1447) 10 db 200 ml-es Erlenmeyer-lombikban oldjuk. A lombikok 50 ml következő összetételű sterilizált oltóközeget tartalmaznak: 3 % glükóz, 1,5 % polipepton, 1 % húskivonat, 0,8 % élesztőkivonat, 0,5 % nátrium-klorid, 0,2 % vízmentes nátrium-acetát, 0,005 % mangán-szulfát (mintegy 4 H2O) és 0,001 % nikkel-szulfát (6 H2O) (pH - 7,0, 30 %-os nátrium-hidroxiddal semlegesítve). A lombikokat stacioner körülmények között 34 'C hőmérsékleten 24 órán keresztül inkubáljuk. Az így készített oltóközegeket 10 db 2 literes Erlenmeyer-lombikba töltjük át. Az egyes lombikok 1 liter azonos összetételű sterilizált tápközeget tartalmaznak. Az inkubációt stacioner körülmények között 32 °C hőmérsékleten 2 napig végezzük. Az eljárással 10 liter tenyésztőfolyadék állítható elő, a savas ureáz aktivitása 21,6 U/ml. A fenti tenyésztőfolyadékból centrifugálással nyerjük ki a sejteket, majd azokat 0,05 M foszfátpufferral (pH ■= 7,2) kétszer mossuk, és 4 liter 0,05 M foszfátpuffert (pH - 7,2), 1 mM EDTA-t és 1 mM ditiotreitolt tartalmazó oldatban szuszpendáljuk. A sejtszuszpenzióhoz ezután 2 liter 0,1-0,2 mm közötti átmérőjű üveggyöngyöt adunk, majd mechanikusan szétbontjuk 4500 ford./percnél 20 percen keresztül. A szétbontott sejtszuszpenziót centrifugáljuk, és a felülúszóhoz etanolt adagolunk 80 %-os végkoncentrációval. Az üledéket centrifugálással gyűjtjük össze és 1 mM EDTA és 1 mM 2-merkapto-etanolt tartalmazó 0,05 mólos trisz-HCl-pufferban (pH - 7,0) oldjuk. Az oldatot Se-phadex G-100-as oszlopra visszük (7,5 cm átmérőjű, és 90 cm hosszú), az adszorpciót és az eluciót ugyanezzel a pufferoldattal végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük. Ezt az eluátumot Sephadex G-200-as oszlopra visszük (4,5 cm átmérőjű és 150 cm hosszú), amely ugyanezzel a pufferrel van kiegyenlítve, az adszorpciót és az eluciót itt is ugyanezzel a pufferral végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük, és egy további DEAE-Sephadex CL-6B adszoipciős oszlopra visszük, az eluálást a gradiens eluálási módszerrel végezzük. Ugyanezt a pufferoldatot alkalmazzuk, amely 0-0,7 M nátrium-kloridot tartalmaz. Az aktív frakciókat egyesítjük. Ezt az oldatot ultraszűrővel koncentráljuk, Amicon 8200 UK- 50-es membránt alkalmazva (molekulatömeg leválasztása 50 000-nél). A puffert ekkor 0,005 M foszfátpufferral váltjuk fel (pH - 7,0), amely 1 mM 2-merkapto-etanolt tartalmaz. Ezután az oldatot affinitás-gélkromatográfiás oszlopra visszük (4 cm átmérőjű és 50 cm hosszú), amelyet Affiprep 10-zel (a Bio-Rad cég terméke) és adszorpciós célra szolgáló hidroxi-karbamiddal készítettünk el. Gradiens eluálást végzünk 0,005-0,044 M foszfátpufferral. Az aktív frakciókat egyesítjük, és a fent említett ultraszűrőt alkalmazva töményítjük. Ezután ffakcionális kicsapást végzünk, majd liofilizáljuk a terméket. így 104 mg tisztított enzimport kapunk. Ennek a pornak a fajlagos aktivitása 336,5 U/mg fehérje, poliakrilamidgélelektroforézissel egyetlen fehérje sávot mutat. A tisztítási lépéseket az 1. táblázatban tüntettük fel. A fenti módszerrel kapott liofilizált savas enzim enzimkémiai és fizikokémiai tulajdonságai a következők: A savas ureáz (1) Hatása Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel. (2) Szubsztrátspecifitása Az enzim főként a karbamidra hat, valamint bizonyos mértékben az etil-karbamidra, biurétra, metilkarbamidra, allantoinsavra és allantoinra (lásd a 2. táblázatot). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
