202918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás savas ureáz előállítására
1 HU 202 918 B 2 A találmány tárgya eljárás új ureáz előállítására, amelyet enzimként lehet használni szeszes italok minőségének javítására és karbamid meghatározására klinikai laboratóriumokban, vagy élelmiszerekben. Az ureáz (E. C. 3. 5. 1. 5) az az enzim, amely a karbamidot ammóniává és széndioxid gázzá bontja le, és amely igen elterjedt a természetben, növényekben, állatokban és mikroorganizmusokban. Kereskedelmi forgalomban is kapható a Canavalia Adans-ból és a Bacillus pasteuriiből készített ureáz. Ezenkívül ismeretesek egyéb ureázok is, így például a mintegy 440 000 molekulatömegű ureáz, amelyet a Corynebacterium lilium, Brevibacterium ammoniagenes, Arthrobacter paraffmeus, Proteus vulgaris, Microbacterium ammoniaphilum vagy Bordetella bronchiseptica baktériumtörzsek készítenek (lásd a 60-55 119 számú japán közzétételi iratot); a mintegy 440 000 molekulatömegű ureáz, amelyet a Bacillus sp. UR-155 készít (lásd az 59-17 987 számú japán nem vizsgált közzétételi iratot), valamint a mintegy 280 000 molekulatömegű ureáz, amelyet a Pseudomonas aeruginosa és Nocardia erythropolis készít, és amely a 61-257 183 számú japán nem vizsgált szabadalmi leírásban található. Valamennyi említett ureáznak az optimális pH értéke a semleges és a lúgos tartományban található, a savas tartományban nemcsak labilis és dezaktiválódásra hajlamos, hanem nehezen is lép reakcióba. Különösen abban az esetben, amikor a reakció hőmérséklete szobahőmérséklet feletti, vagy a reakciórendszer szerves oldószert, például alkoholt tartalmaz, ezek az ureázok igen erősen inaktiválódnak. A fentiek miatt intenzív kutatásokat végeztünk, hogy olyan mikroorganizmust találjunk, amely olyan ureázt termel, amelynek optimális pH-ja a savas tartományban van és ott igen stabil is. Azt találtuk, hogy egy, a Lactobacillus és a Streptococcus nemzetséghez tartozó baktériumtörzs ezt a kívánt ureázt halmozza fel a sejtjeiben. Ezt az enzimet izoláltuk és tisztítottuk, és további kutatásokat végezve jutottunk a jelen találmányhoz. A találmány tárgya tehát eljárás új, olyan ureáz előállítására, amelynek pH optimuma a savas tartományban van (ezután ezt az ureázt savas ureáznak nevezzük), és amelynek a következő fizikokémiai tulajdonságai vannak: 1) Hatása: 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel, 2) Szubsztrátspecifítása: a karbamidra hat, 3) pH optimuma és pH stabilitása: pH optimuma 1,5 és 5,5 között van, pH 6-8 között 37 °C-on 30 percig stabil, 4) hőmérséklet-optimuma és hőmérséklet-stabilitása: hőmérséklet-optimuma a pH-optimumán 55 °C és 75 °C között van, pH 6-nál 50 °C hőmérsékletig 30 percig stabil marad, 5) Inhibitorai: higany(II)-klorid és acetohidroxámsav gátolja, 6) molekulatömege: gélszűréssel meghatározva 100 000-250 000 dalton között, 7) fajlagos aktivitása: a pH-optimumon, 37 °C-on legalább 20 U/mg fehérje. Az eljárást úgy végezzük, hogy megfelelő tápközegben tenyésztünk valamely a Lactobacillus fermentum, Lactobacillus renteri, Lactobacillus ruminis, Streptococcus bovis, Streptococcus mitior vagy Streptococcus salivarius fajhoz tartozó mikroorganizmust. A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazható savas ureázt termelő mikroorganizmusok közül konkrét példaként megemlíthetjük a következőket: Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14 511, FERM P-8990), Lactobacillus fermentum JCM 5868 (JFO 14 512, FERM P-8991), Lactobacillus fermentum JCM 5869 (IFO 14 513, FERM P-8992), Lactobacillus reuteri UM-12 (IFO 14 629, FERM P—9456), Lactobacillus reuteri UM-18 (IFO 14 630, FERM P- 9457), Lactobacillus reuteri Rt-5 (IFO 14 631, FERM P-9458), Lactobacillus ruminis PG-98 (IFO 14 632, FERM P-9459), Streptococcus mitior PG-154 (IFO 14 633, FERM P-9460), Streptococcus bovis PG-186 (IFO 14 634, FERM P-9461) és Streptococcus salivarius PG-303W (IFO 14 746). Az itt szereplő IFO számok az Osakai Fermentációs Intézet (IFO) deponálási számai. Az intézet címe: Institute for Fermentation, Osaka (IFO) 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japán. Az FERM P számok a fermentációs kutatóintézet (Fermentation Research Institute (FRI) deponálási számai, cím: Fermentation Research Institute, (FRI), Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higshi 1-chome, Tsukuba-shik, Ibaraki-ken 305, Japán. A Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14 511), Lactobacillus fermentum JCM 5868 (IFO 14 514) és Lactobacillus fermentum JCM 5869 (IFO 14 513) ismert törzsek, amelyek az IFO által kiadott kutatási közleményekben (13. szám, 94. oldal, 1987) szerepelnek. Ezeket a mikroorganizmusokat, amelyek az FRI-nél voltak deponálva a kővetkező táblázatban szereplő napokon, átalakítottuk a Budapesti Szerződés szerinti deponálássá, és az FRI-nél helyeztük letétbe a következő táblázatban szereplő FERM BP katalógus számokkal. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Mikroorganizmus FRI-nél történt Bp. Szerződés szerinti deponálás dátuma katalógusszám Lactobacillus fermentum JCM 5867 Lactobacillus fermentum JCM 5868 Lactobacillus fermentum JCM 5869 Lactobacillus reuteri UM-12 1986. október 4. 1986. október 4. 1986. október 4. 1987. július 7. FERM BP-1454 FERM BP-1445 FERM BP-1446 FERM BP-1904 2
