202916. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új gamma-glutamil-transzpeptidáz mikrobiológiai előállítására
1 HU 202 916 B 2 140 |il térfogatú 250 mmól/1 töménységű kálium-foszfát-pufferoldatot (pH-5,0), továbbá 10-50 pl enzimoldatot adunk, majd az elegyet 33 *C hőmérsékleten inkubáljuk. 10 percenként 20 pl térfogatú mintákat veszünk te belőle, és a reakciót 20 pl metanol hozzáadásával leállítjuk. Ezt követően a vizsgálati mintákat centrifugáljuk, majd 1:10 térfogatarányban vízzel meghígítjuk. A szabaddá váló aminosavat a 7. példában leírtak szerint HPLC-vel vagy vékonyrétegkromatográfiával és UV abszorpció vizsgálattal mutatjuk ki. Fentiek szerint eljárva az alábbi glutaril-monoaminosav- származékokat hidrolizáljuk gamma-glutamiltranszpeptidáz segítségével: glutaril-alanin, glutaril-valin, glutaril-fenil-alanin és glutaril-valin-terc-butil-észter. A vizsgálatokkal a hidrolízis egyértelműen kimutatható. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás új, adipinil- vagy glutaril-monoamino-vegyületek hidrolízisére alkalmas gamma-glutamiltranszpeptidáz (y-GTP) mikrobiológiai előállítására, amelynek molekulatömege 20 000-60 000 dalton, izoelektromos pontja pH-5,0-6,5 L-y-p-nitro-anilid szubsztrát esetén pH-optimuma 6,5-10 és pH-8,Onál Km értéke 9-36 pM, azzal jellemezve, hogy Pseudomonas fragi vagy Pseudomonas putida vagy Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgáris vagy Arthrobacter parafineus vagy Bacillus subtilis baktériumokat tenyésztünk, amíg az enzim felhalmozódik. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentációhoz Pseudomonas putida-t ATCC 17390 vagy Pseudomonas aeruginosa-t NCTC 10701 vagy Proteus vulgaris-t ATCC 9634 vagy Arthobacter parafineust ATCC 31917 vagy Pseudomonas fragi-t DSM 3881 vagy Bacillus subtilis-t IFO 3025 vagy ezek y-GTP-t termelő mutánsát vagy variánsát alkalmazzuk. 3. Az 1-3. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 20-37 *C hőmérsékleten végezzük. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 25-30 °C hőmérsékleten végezzük. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 5-8,5 pH-n végezzük. 6. Eljárás R1-(CH2>3-CO-NH-R2 általános képletű adipinil- vagy glutaril-monoaminovegyületek - a képletben R1 jelentése karboxilcsoport, karboxi-karbonil-csoport vagy karboxi-metil-csoport, R2 jelentése aminosav-, dipeptid-, cefém-, cefám-maradék -enzimes hidrolízisére, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypont szerint előállított y-glutamil-transzpeptidáz enzimmel hidrolizálunk. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás a-keto-adipinilvagy glutaril-7-amino-cefalosporánsav enzimes hidrolízisére, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypont szerint előállított y-glutamil-transzpeptidáz enzimmel hidrolizálunk. 5 10 15 20 25 30 5
