202916. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új gamma-glutamil-transzpeptidáz mikrobiológiai előállítására
1 HU 202 916 B 2 A találmány tárgya eljárás új, adipinil- vagy glutarilmonoamino-vegyületek hidrolízisére alkalmas gamma-glutamil-transzpeptidáz (y-GTP) mikrobiológiai előállítására, amelynek molekulatömege 20 000 - 60 000 dalton, izoelektromos pontja pH-5,0-6,5, L-y-glutamil-p-nitro-anilid szubsztrát esetében az enzim pH-optimuma 6,5-10, és pH-8,0-nál Km értéke 9-36 pM. A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy Pseudomonas fragi vagy Pseudomonas putida vagy Pseudomonas aeruginosa vagy Proteus vulgaris vagy Arthrobacter parfineus vagy Bacillus subtilis baktériumokat tenyésztünk, amíg az enzim felhalmozódik. A y-transzpeptidázok (y-GTP) az állati szövetekben és mikroorganizmusokban fontos szerepet játszanak az aminosav anyagcserefolyamatoknál és a glutation-ciklusban [Meth. Enzymol. 77, 237 (1981)]. Felelősek a különböző aminosavak, a y-glutamilszármazékok szállításáért, bacillusokban a poliglutaminsavak képzéséért, valamint a glutation (y-glutamil-ciszteinil-glicin) lebontásáért. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy némely mikroorganizmus olyan y-GTP-t szintetizál, amellyel az említett reakciókon kívül adipinil- vagy glutaril-mono-aminovegyületek is hidrolizálhatók, amely vegyületek, eddig y-GTP enzimmel nem voltak hidrolizálhatók. A találmány szerinti eljárással előállított új y-glutamil-transzpeptidázra (y-GTP) jellemző: hogy molekulatömege 20 000-60 000 D, izoelektromos pontja pH- 5,0-6,5, L-y-glutamil-p-nitro-anilid szubsztrátum esetén pH- optimum-6,5-10, pH-8,0-nál Km-9-36 pM. A találmány szerinti eljárással előállított y-glutamiltranszpeptidáz (y-GTP) például az R1-(CH2)3-CO-NHR2 általános képlető glutaril- vagy adipinil-mono-amino-vegyületeknek a megfelelő savra és mono-aminovegyületre történő hidrolízisét katalizálja. A képletben R1 jelentése karboxilcsoport, karboxi-karbonil-csoport vagy karboxi-metil-csoport, R2 jelentése aminosav-, dipeptid-, cefém-, cefám-maradékok, vagy ezek származékai. Szubsztrátként előnyösek a 7-amino-cefalosporánsav-származékok, különösen az a-keto-adipinil- vagy a glutaril-7-amino-cefalosporánsavak. A mikroorganizmusokban a y-GTP periplazmatikusan fordul elő és jellemzői: a 20 000-60 000, előnyösen 23 000-40 000, különösen elnyösen 30 000- 35 000 dalton molekulatömeg, valamint pH-5,0- 6,5, előnyösen pH-5,7-6,1 izoelektromos pont. Az enzim pH-optimuma L-y-glutamil-para-nitro-anilid szubsztrátum esetében pH-6,5-10. Ugyanerre a szubsztrátumra a találmány szerinti transzpeptidáz Km értéke 9- 36 pM, előnyösen 15-20 pM, előnyösen 8,1 pM, ha pH-8. Azaszerin vagy jód-acetamid jelenlétében irreverzibilisen gátolt a találmány szerinti y-GTP. Réz, higany, valamint szerin és borát-keverék, valmint 7-amino-cefalosporánsav jelenlétében az enzim reverzibilisen gátolt. Az előállítás mikroorganizmus segítségével történik. Találtunk olyan baktériumokat, különösen Pseudomonas, Proteus, Arthrobacter és Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusokat, amelyek a találmány szerinti y-GTP-t jó hozammal termelik. Előnyösen alkalmazhatók például a Pseudomonas putida ATCC 17390, a Pseudomonas aeruginosa NCTC 10701, a Proteus vulgaris ATCC 9634, Arthobacter parafineus ATCC 31917, valamint a Pseudomonas fragi DSM 3881 és a Bacillus subtilis IFO 3025. Különösen előnyös a Pseudomonas fragi DSM 3881-ből nyert enzim. Az említett mikroorganizmusok mutánsait és variánsait is alkalmazhatjuk. A mikroorganizmusok tenyésztése aerob módon egyenként vagy kevert kultúrákban például süllyesztett tenyésztéssel rázás közben vagy rázólombikban keverés közben vagy fermentorban keverés közben, adott esetben levegő és oxigén bevezetéssel történik. A fermentációt 20-37 °C hőmérsékleten, előnyösen 28- 30 °C-on végezzük. A fermentálás 5-8,5, előnyösen 5,5-8,0 pH-tartományban zajlik. Ilyen körülmények között 1-3 nap múlva a fermentlében jelentős enzimmennyiség gyűlik össze. A y-GTP szintézise késő logfázisban kezdődik és a maximumot a stacionáris növekedési fázisban éri el. A periplazmatikus enzimtermelést aktivitás vizsgálattal, HPLC-analízissel illetve fotometriás méréssel követhetjük nyomon. A y-GTP termeléshez alkalmazott tápoldat 0,2-5%, előnyösen 0,5-2,0% szerves nitrogénvegyületet, valamint szervetlen sókat tartalmaz. Szerves nitrogénvegyületként alkalmazhatunk aminosavakat, peptonokat, továbbá húskivonatokat, őrölt magvakat, például kukoricát, búzát, babot, szóját vagy gyapotmagvat, alkoholgyártásból származó desztillációs maradékot, húslisztet vagy élesztőextraktumot, alkáliföldfémvagy alkálifém-karbonátot, -szulfátot vagy alkálifémvagy alkáliföldfém-foszfátot, vasat, cinket és mangánt, azonban felhasználhatunk ammóniumsókat és nitrátot is. Az asszimilálható szénhidrátok adagolása növeli a biomassza kitermelését. Az említett koncentrációkban ugyancsak felhasználhatunk szénhidrátokat. ELőnyös szénforrásként adagolhatunk például cukrot, így glükózt vagy szacharózt, valamint szénhidráttartalmú természetes termékeket, így malátakivonatot adhatunk a tápoldatba. Bár az optimális fermentálási körülmények minden mikroorganizmusra eltérőek, azonban ezek vagy a szakember számára már ismertek vagy egyszerű előkísérletekkel meghatározhatók. A tisztítás hagyományos eljárással, így lizozimes feltárással, ammónium-szulfátos kicsapással, ioncserés- és géláteresztős kromatográfiával történhet. Az enzimkapcsolást szokásos módszerei végezzük (Colowick és Kaplan, Meth. Enzymol., XLIV. kötet). Az enzimes átalakításhoz felhasználhatunk mind teljes sejteket szabad vagy kötött formában ß-laktamáz-inaktivátorok, így klavulánsav vagy tienamicin 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
