202886. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-származékok előállítására

1

HU 202 886 B

2

[A példa végén közölt HPLC-elemzés körülményei: 8x10 mm-es oszlop, 10 pm-es adszorbenssel (Waters), eluens: A-puffer (50 mmól tetraetilammónium-foszfát, 0,25 mmól nátrium-perklorát, 10t% acetonitril; pH 3,0) és B-puffer (50 mmól tetraetilammónium-foszfát,

90 tf% acetonitril, pH-3,0) 72:28 és 60:40 közötti gradiense. Térfogatsebesség: 1,5 ml/perc, szobahőmérséklet. Detektálás 210 nm hullámhossznál].

A majom-proinzulin szekvenciájú, 31-es helyzetben lizint és 32-es helyzetben arginint tartalmazó proinzulinból 10 mg-ot 20 ml 0,1 mólos, 7,2 pH-jú, 0,5 mg/ml mennyiségben timolt tartalmazó trisz-pufferben feloldunk. Az oldathoz 0,1 egység mennyiségű tripszint adunk, és az elegyet rázóasztalon, enyhe mozgatás mellett, szobahőmérsékleten inkubáljuk. Néhány óra elteltével éles élű, mintegy 2-30 pm méretű kristályok képződnek. A savasreakcióoldat 1 nap elteltével a HPLC-elemzés szerint az alábbiakat tartalmazza: 87% humáninzulin-LysB31- ArgB32-OH, 8% humáninzulin- Lys“ -OH és 3% dez-Thr (30)-humáninzulin. A kristályokat centrifugáljuk és az inzulin- származékot ismert módon - anioncserélővei végzett ultratisztítással - feldolgozzuk.

Aminosavelemzés

számított

talált

számított

talált

Asp

3

3,00

Thr

3

2,85

Ser

3

3,12

Glu

7

7,33

Pro

1

0,91

Gly

4

3,78

Alá

1

1,02

Val

4

3,31

Cys

6

5,12

Be

2

1,36

Leu

6

5,85

Tyr

4

4,20

Phe

3

3,08

Lys

2

1,95

His

2

2,10

Arg

2

1,91

4. példa

Humáninzulin-ArgB31-ArgB32-OH előállítása E. coli-ban exprimált majom-preproinzulinból, tripszines emésztéssel

50 ml 0,1 mólos, 7,2 pH-jú citrátpufferben, amely 0,5 mg/ml timolt és 0,5 mg/ml fenolt tartalmaz, 1,0 g majom preproinzulint feloldunk, és a 25 'C-os oldathoz 10 egység szarvasmarha eredetű tripszint adunk (a tripszint előzetesen tozil-fenil-klórketonnal kezeltük a kimotripszin inaktiválása céljából). A termék 5- 50 pm élhosszúságú hasáb alakú kristályok formájában kiválik az elegyből. 24 óra elteltével a reakciót 3 mg tripszin-inhibitor hozzáadásával megszakítjuk, a csapadékot centrifugáljuk, majd 4 pH-jú, 0,05 mólos ammónium-acetát-puffer-oldatban (amely 0,1% nemionos detergenst tartalmaz) feloldjuk és az 1. példában leírt módon ioncserélő alkalmazásával finomtisztításnak vetjük alá.

Hozam: 403 mg (az elméleti hozam 64%-a) humáninzulin-Arg-Arg. A végterméket aminosav-elemzéssel, magasnyomású folyadékkromatográfiás módszerrel és az oldhatósági görbéjével azonosítjuk.

Aminosav-elemzés

számított

talált

Asp

3

3,00

Thr

3

2,86

Ser

3

2,81

Glu

7

7,29

Pro

1

1,05

Gly

4

4,09

Alá

1

1,03

Val

4

3,25

Cys

6

5,10

Ile

2

1,27

Leu

6

5,92

Tyr

4

3,78

Phe

3

2,90

Lys

1

1,00

His

2

1,97

Arg

3

2,94

Az 5. ábra azt mutatja, miképp különbözik a tennék (humáninzulin-ArgB31-ArgB32-OH) oldhatósága a természetes humán-inzulin oldhatóságától (0,25 mmólos acetát/foszfát-puffer; cink nélkül). Látható, hogy a két Arg-csoport révén az oldhatatlansági maximum két pH lépcsővel a fiziológiai tartomány felé eltolódik.

A példákban említett HPLC méréseket az alábbi irodalom alapján végeztük: Gerhard Seipke, Hubert Müller, Ulrich Grau: „High-Pressure Liquid Chromatography (HPLC) of Proteins” Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 25 (1986) 535-552.

SZABADALMI IGÉNYPONT

Eljárás (I) általános képletű inzulin-származékok előállítására - az (I) általános képletben R30 jelentése L-Ala- vagy L-Thr-csoport, n értéke 1 vagy 2,

X jelentése -L-Arg csoport és Y jelentése H-L-Phe-csoport - legfeljebb 30 pm szemcseméretűkristályok formájában, proinzulin-prekurzorok, proinzulin, preproinzulin vagy analógjaik tripszinnel végzett lebontás útján, azzal jellemezve, hogy a lebonást az (I) általános képletű inzulin-származék izoelektromos pontjától számított ± 1 pH tartományban, fenol vagy krezol jelenlétében végezzük, és a kiindulási anyagot 0,5-30 mg/ml koncentrációjú oldat alakjában visszük reakcióba.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

4