202886. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-származékok előállítására
1 HU 202 886 B 2 A találmány tárgya új eljárás ismert inzulin-származékok előállítására. Az inzulin in vivo szintézise során egyik prekurzora, a pre-proinzulin képződik. Ebben a pre-szekvencia a membránokkal való kölcsönhatásokat elősegítő jelzőszakaszként szerepel; még a szintézis alatt, vagy közvetlenül utána a pre-szekvencia lehasad. A proinzulin hasnyálmirigykivonatokban csekély mennyiségben kimutatható vegyület; inzulinná válása közben fajlagos enzimrendszer a C-peptidet hasítja le róla. A lehasítás helyét, azaz az enzimek támadási pontját a B31 és B32 helyzetű Arg-Arg szekvencia (B30 a B-lánc későbbi C-terminálist képezi), illetve a 62-es (illetve A 1) és 63-as (illetve A 0) helyzetű Lys-Arg szekvencia képezi, a későbbi A-lánchoz képest N- terminálisán elhelyezkedve. Tripszines és B-karboxipeptidáz-aktivitással rendelkező enzimek segítségével a proinzulin in vitro is simán inzulinná alakítható [Kemmler et al„ JBC 246, 6786-91 (1971)]. Csak tripszinnel vagy tripszinhez hasonló enzimekkel végzett proteolízis során inkább az olyan közbenső termékek keletkeznek, amelyek a B-lánc C-terminális végén, a 31-es és 32-es helyzetben az egyik vagy mindkét arginint hordják; emellett az inzulinnak olyan bomlási termékei, amelyek B- terminálison lizin-(B29)-inzulinná (-dez-alanin-(B30)-sertésinzulin, dez-treonin(B30)-humáninzulin), vagy (B22)- argininná (-dezoktapeptid-inzulin) hasadtak [Chance, Proc. VII Congress of International Diabetes Fed., (1970); D.E. Steiner et al., Fed. Proc. 33, 2105-15 (1974); J. Markussen: Proc. Symp. on Proinsulin, Insulin, C-Peptide, Tokushima (1978)]. Géntechnológiai módszerekkel a pre-proinzulinokat ma már prokariotákból, főleg E. coli-ból lehet előállítani. Különösen értékesek az olyan törzsek, amelyek a humán inzulin szekvenciáját tartalmazó proinzulint tartalmaznak. A plazmidok módosításával új szakaszok szerkesztése is lehetővé vált, így például a proinzulin 31-33. és 61-63. helyzetében történő változtatások, amelyek természetesen az inzulin vagy inzulin-származék felszabadításához szükséges enzimes, illetve kémiai hasítási helyeket nem érinthetik. Előállíthatok például olyan származékok, amelyek 31-es és 32-es helyzetben (egy vagy két arginin helyett) más bázikus aminosavat, tehát lizint vagy hisztidint tartalmaznak; ezek tripszinszerű enzimekkel is hasíthatók. Olyan szekvenciák is beépíthetők a molekulába, amelyek egyéb ismert proteolitikus enzimek szubsztrátumait képezik, vagy kémiai módszerekkel végzett hasítást tesznek lehetővé. Jelen találmány szempontjából csak egy feltétel van: a proinzulin-analóg megfelelő hasítása során olyan inzulin keletkezzék, amelynek az A- lánc N-terminálisa előtt nincs járulékos aminosava, és a B-lánc C-terminálisához kapcsolódó legfeljebb három járulékos aminosav közül (31-33. helyzet) legalább egy bázikus aminosav legyen. A B-lánc C-terminálisán járulékos pozitív töltéseket tartalmazó inzulin-származékok, előállításuk és felhasználásuk a T/34889 (2765/84 ügyszámú), valamint a T 37805 (2766/84 ügyszámú) szám alatt közzétett magyar szabadalmi bejelentés tárgyát képezi; kristályosításukra irányuló eljárást a T/35001 (2841/84 ügyszámú) számon közzétett magyar szabadalmi bejelentés ismerteti. Azt találtuk, hogy az (I) általános képletű inzulinszármazékokat - az (I) általános képletben R30 jelentése L-Ala, vagy L-Thr, n jelentése 1 vagy 2 X jelentése L-Arg Y jelentése pedig H-L-Phe - legfeljebb 30 pm szemcseméretű kristályok formájában állíthatjuk elő proinzulin-prekurzorok, proinzulin, preproinzulin vagy analógjaik tripszinnel végzett bontás útján. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy a bontást az (I) általános képletű inzulin-származékok izoelektromos pontjától számított ± 1 pH tartományban, fenol vagy krezol jelenlétében végezzük, és a kiindulási anyagot 0,5-30 mg/ml koncentrációjú oldat alakjában visszük reakcióba. A módszer előnye kettős: egyrészt a termék kicsapódik a reakcióoldatból, tehát a reakció egyensúlya a termék képződése irányában eltolódik, másrészt a megadott körülmények között éles élű, hasábalakú kristályok képződnek, amelyek - kisebb felületük miatt - kevésbé reagálnak tovább, mint például amorf csapadékok. Meglepő például, hogy az inzulin-ArgB31-OH származék a további tripszines bontással szemben igen ellenálló. A pH-érték beállításához alkalmas puffert (acetátot, citrátot vagy foszfátot) alkalmazunk. Előnyösen úgy járunk el, hogy a kiindulási anyag koncentrációja 0,5-30 mg/ml, előnyösen 1-10 mg/ml körüli érték, és a reakciósebesség a kristályképződés sebességével azonos, vagy csekély mértékben meghaladja azt. Ezzel azt biztosítjuk, hogy sok kristálycsíra képződik, és a kristályok átlagos mérete a 30 jxm-t nem haladja meg. Enzim katalitikus reakciók esetén a reakciósebesség igen pontosan állítható be a kívánt értékre. A találmány szerinti eljárásban a reakciót jobban a kívánt termékre irányítjuk, így a hozam észrevehetően növekszik. A tennék olyan alakban képződik, amely alkalmas a további feldolgozáshoz, és a rátapadó felesleges tripszin egyszerű mosással majdnem teljesen eltávolítható. Az (I) általános képletű inzulin-származékok és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények esetén a késleltetett hatóanyagleadás egy teljesen újszerű elve érvényesül; nincs szükség a késleltető segédanyagokra, például cinkre vagy protamin-szulfátra. A késleltető hatás egy inherens, a proteinkémiából adódó fizikai tulajdonságra, az inzulinnak az izoelektromos pont körül csökkenő oldékonyságára vezethető vissza. Fiziológiai körülmények között feltehetőleg a járulékos bázikus csoportok lehasítása során megy oldatba; a származék szerkezetétől függőén tripszin vagy tripszinhez hasonló enzimek és/vagy B-karboxipeptidáz vagy ahhoz hasonló enzimek vagy észteráz-aktivitású enzimek hatására hasad le a bázikus csoport. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
