202883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-interferon előállítására és tisztítására
1 HU 202 883 B 2 oligomerektől és dimerektől/trimerektől/tetramerektől mentesek; monomertartalmuk több, mint 90%-a natív-monomer a-interferon; nem-natív-monomer interferontól mentesek; 5 Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Met Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Gin Phe Gin Lys Ala Glu Thr Ile Gin Gin Ile Phe Asn Leu Phe Ser Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin aminosavszekvenciájú; a Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Met Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Gin Phe Gin Lys Ala Glu Thr Ile Gin Gin Ile Phe Asn Leu Phe Ser Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin aminosavszekvenciának megfelelő rekombináns humán-a- interferon homogén, tiszta formában, 5%-nál kevesebb metionin- interferont, 0,2%-nál kevesebb oligomert és 2%-nál kevesebb dimer/trimer/tetramert tartalmaz, az a-interferon redukált formáitól és töredékeitől mentes, és monomertartalmának több, mint 90%-a natív-monomer a-interferon az 1 és 98 és a 29 és 138 helyzetű ciszteinek között egy-egy diszulfidhíddal. A találmány tárgyát képezik még a találmány szerint előállított a-interferont tartalmazó gyógyszerkészítmények is. Fermentáció és a biomassza nyerése: Az a-interferont (IFN-a) kódoló DNS-t tartalmazó pER33 plazmiddal (EP-A-0 115. 613) transzformált E. coli HB101 baktériumot szokásos módon U9 minimál táptalajban - amelyhez triptofán kivételével minden aminosavból 20 jig/ml-nyi mennyiséget, valamint 1 pg/ml tiamint, 0,2% glükózt és triptofán-operon induktorként 20 pg/ml indol-3-akrilsavat [IAA; lásd Hallewell and Emtage, Gene 9,27-47 (1980)] adunk - addig tenyésztünk - előnyösen 8-9 óra hosszat - amíg a lehetőség szerinti legkevesebb metionin-interferon képződik. Utána a baktériumokat 10 percig 7000 ford./perc-nél végzett centrifugálással ülepítjük, egyszer mossuk 50 mM trisz.HCl és 30 mM nátrium-klorid tartalmú, 8 pH-jú oldattal, majd végül ugyanilyen összetételű pufferban szuszpendáljuk. antitesteket nem stimulálnak; szilárd formában vannak. A találmány tárgyát képezi a humán a-interferon, amelyre az jellemző, hogy a Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Pro Val Leu His Glu Met De Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Val Ile Gin Gly Val Gly Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Pro Val Leu His Glu Met De Thr Lys Asp Ser Ser Ala Alá Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Val Ile Gin Gly Val Gly Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu A : szuszpenzióban levő baktériumokat elöljük úgy, hogy a pH-t ásványi savval 2,0 és : 2,5 közé állítjuk. Az elölt baktériumsejteket elkülönítjük, és -20 *C-on mélyhűtve megfagyasztjuk. 1. példa (E. coli fermentlé; a2 Arg-interferon; 28 °C). a) 251 g savval lecsapott biomasszát, amelyet -20 °C- on tároltunk, 2500 ml 1%-os ecetsavoldatban 1/2 óra hosszat keverünk jeges fürdőben, és Ultraturax Typ 45/6 segítségével 2-szer 1 percig homogenizálunk. Polymin P-t [50.000-60.000 átlagos molekulatömegű poü(etilén-imin) 50%-os vizes oldata] adunk hozzá 0,25 t% végkoncentrációig, a pH-t 5 n nátrium-hidroxidöldattal 10,0-re állítjuk, és az elegyet 2 óra hosszat keverjük jeges fürdőben, végül a pH-t 5 n sósavoldattal 7,50-re visszaállítjuk. Christ Cryofuge 6-6 S-en 4 °C-on és 3000 ford/percen végzett 1 órás centrifugálás után 2540 ml tiszta nyersextraktumot kapunk, amelynek inteferontartalma 17.1X109 I.E. (. 100%) és proteintartalma 5330 mg, amiből 3,21x10s I.E7mg protein fajlagos aktivitás adódik. b) Az oldathoz 65%-os telítésig adunk ammóniumszulfátot (430 g/liter extrakt). Az elegyet éjszakán át 4-8 *C-on hagyjuk állni, és a keletkezett csapadékot egy Beckmann J 2-21 ultracentrifugán JA 10-es rotor-35 40 45 50 55 60 9
