202867. lajstromszámú szabadalom • FANTÁZIA (fiókos bárszekrény)
1 HU 202 867 B 2 Hím patkányok egyes immunológiai paramétereire gyakorolt hatás Az esetleges immunitást fokozó vagy immunmoduláló hatás megállapítására fiziológiás vagy parafiziológiás immunhiányos modelleket alkalmazunk. 5 Az ilyen célra leggyakrabban alkalmazott modellek egyike az öregedés. Az öregedés valójában a T segítő limfociták funkciója csökkenésével kapcsolatos, és a T limfociták kapcsolatos immundependens válaszok csökkentésével, ezek: késleltetett típusú hiperszenzitivi- 10 tás, mitogén szerekre adott proliferativ válasz, a T citolitikus sejtek defferenciálódása. Ezeknek a jelenségeknek a mechanizmusa összefüggésbe hozható a csecsemőmirigy elkorcsolulása folytán bekövetkező csökkent csecsemőmirigy- hormon-termeléssel, a T-szupresszor- 15 sejtek indukciójával és az interleukin 2 megváltozott szintézisével vagy felhasználásával. Úgy tűnik, hogy a B sejtek kevéssé érintettek ezekben a jelenségekben. Ezért a PGTCA-val végzett in vivo kezelés fiatal és idős állatokon vizsgáltuk, két vizsgálatot alkalmaz- 20 va, amelyek a limfocita sejt reaktivitást mutatják. A vizsgálatokhoz felnőtt, 5-6 hónapos hím patkányokat alkalmaztunk a normál immunrendszer modelljeként és idős, 17-18 hónapos patkányokat a parafiziológiás immunhiányos modell képviselőiként. 25 A PGTCA-val való kezelést 1,10 és 50 mg/kg dózis napi kétszeri i.p. beadásával végezzük 4 héten át. Az alkalmazott immunológiai vizsgálatok: a dinitro-klórbenzol (DNCB) által kiváltott késleltetett típusú hiperszenzitivitás és a T limfociták reakciója konkavalin A- 30 ra (ConA). DNCB szenzitizálás 4 hetes PGTCA-val vagy hordozóanyaggal végzett előkezelést követően minden állatot (csoporton- 35 ként 5 főt) 0,02 ml, 200 mg/ml-es acetonos DNCB-lal kezelünk a háti bőrrészen körülbelül 1 cm2-es felületen. Az ezt követő gyulladásos reakciót a megpirosodott felületnek kalibrátorral való mérésével követjük nyomon az 1-7. napokon. Ez idő alatt az állatokat fo- 40 lyamatosan kezeljük. Blasztizációs vizsgálat ConA-val 1,10 és 50 mg/kg dózisú PGTCA-val 4 héten át végzett kezelés után az állatokat leöljük, és lépjüket tö- 45 kéletesen steril körülmények mellett eltávolítjuk. Limfocita-izolátumot nyerünk Isolimph gradiens eljárással. A limfocitákat mikrocsészékben 1x10° sejt/ml koncentrációban 2,5 Jig/ml ConA jelenlétében 48 órán át inkubáljuk. A mitogén aktivitást a 3H-timidin 16 óra alatti beépülésével értékeljük. Az eredményekből az látható, hogy az idős állatok DNCB-ra adott válasza - a gyulladásos terület alapján értékelve - csökkent. PGTCA-val végzett kezelés esetén szignifikáns válasz-növekedést csak 50 mg/kg dózisnál észleltünk a fiatal állatoknál, míg az idős állatoknál 10 mg/kg dózisú PGTCA alkalmazásakor már maximális potencírizó hatás figyelhető meg. A PGTCA immunostimuláló aktivitását a ConA-val végzett blasztizációs vizsgálat is alátámasztja. Ennek eredményeit a IV. táblázatban muttajuk be. Ebben az esetben is határozottabb a válasz az idős állatoknál, ami a sejt immunhiány bizonyos mértékére utal. Egereknél a citotoxikus típusú hiperszenzitivitási reakciót alkalmazzuk, a kiértékelést T-sejtek kos vörösvérsejtekkel való rozetta képzése alapján végezzük [S.D. Wilson, Immunology, 21, 233 (1971)]. A kezelést az VA. és VB. táblázatokban bemutatott módon i.p. végezzük 50 mg/kg dózis napi kétszeri alkalmazásával. Körülbelül 25 g testtömegű hím COBS CD-I egereket kezelünk PGTCA-val 8 napon át. A kezelés megkezdését követő 4. napon az állatokat 0,2 ml PSB-ben lévő5xl08 kos-vörösvérsejttel i.p. immunizáljuk. A vörösvérsejtek kinyerésére a citráttal kezelt kosvért 1500 fordulat/perc mellett 10 percig centrifugáljuk, majd a kiülepedett vörösvérsejteket 1200 fordulat/perc mellett 2x10 percig mossuk PBS-ben, az első fázist elkülöníthetjük, majd a sejteket PSB-ben szuszpendáliuk, és Coulter számlálón megszámoljuk, majd 2,5xlÖ9 vörösvérsejt/ml koncentrációra állítjuk be. Az immunizálást követő 6. napon elvégezzük a rozetta vizsgálatot. Az egereket a nyaki csigolya kificamításával leöljük, majd lépjüket eltávolítjuk. A lépet jégben tartott 1 ml Hank-oldatba helyezzük, majd pépesítjük, homogenizáljuk, és gézen átszűrjük. A homogenizált terméket kétszer mossuk Hank-oldatban, 1200 fordulat/perc mellett 10 percig centrifugáljuk, majd ismét szuszpendáljuk. A lépsejt-szuszpenziót (6xl07ml) és 100 jxl 3xl08/pl-es vörösvérsejt szuszpenziót 0,8 ml Hank-oldatban keverünk 1 percig. Mintát veszünk, 24 órán át 4 *C hőmérsékleten keverés mellőzésével. I. Táblázat Dózis (pmól/kg i.p.) Kontroll 4,1 PGTCA 41 205 (4,1+4,1) PGA+TCA (41+41) (205+205) n° 20 20 20 20 20 20 20 Mortalitásié 90 85 75 60 90 85 75 a májkárosodás mértéke a májkárosodás mértékének %-os megoszlása 0 0 0 0 5 0 0 0 1 0 0 5 15 0 0 10 2 0 10 20 15 0 10 15 3 100 90 75 65 100 90 75 3
