202852. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új alkanofenonok és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
49 HU 202 852 B 50 (100 - készítmény compliance) x 100 %-os gátlás = 100 - ------------------------------------------------(100 - kontroll compliance) Ha különböző hatóanyagkoncentrációkat vizsgálunk, minden koncentrációnál ábrázoljuk a százalékos gátlást, az abszcisszán a koncentráció logaritmusát, az ordinátán a százalékos gátlást feltüntetve. Az ICS0 értéket ezután lineáris regressziós analízissel állapítjuk meg. In vitro vizsgálat emberi leukocitából származó foszfolipáz Aj gátlásának meghatározására Neutrofil polimorf maggal rendelkező emberi leukocitákat izolálunk „Buffy coats”-ból, többlépéses frakcionált ülepítéssel majd mélyhűtjük. A sejtszuszpenzióból a foszfolipáz A2-t homogenizálással és jéghideg, 2 n nátrium-kloriddal készített 0,36 n kénsavoldat hozzáadásával extraháljuk, majd a 10 000 g centrifugálás során kapott felülúszót pH = 4,5 értékű nátrium-acetát-pufferral szemben dializáljuk. Az enzimaktivitás meghatározására az enzimet (10— 30 pg protein) 0,1 m trisz/HCl pufferban 37 'C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk 1 raM CaCl2 és bioszintetikus, MC-olajsavval radioaktívan jelölt 2 pM Escherichia coli foszfolipid szubsztiát hozzáadásával. A reakciót Dole-reagens hozzáadásával leállítjuk (izopropanol-heptán-1 n kénsav 40:40:1 tf/tf elegye) és a foszfolipáz A2 által szelektíven felszabadított 14C-olajsavat extraháljuk. Az esetleg átextrahált szubsztrát eltávolítására az extraktumot szilikagéllel töltött oszlopon szűrjük. Az eluátumban jelenlevő uC-olajsavat radiometriásan határozzuk meg. A vizsgált anyagok foszfolipáz A2-vel szemben mutatott gádó hatását úgy határozzuk meg, hogy azokat vízzel, dimetil-szulfoxiddal (legfeljebb 5 tf/tf% végkoncentráció) vagy etanollal (legfeljebb 2,5 tf/tf%) készített oldatként az inkubációs elegyhez adjuk. A vizsgált anyagok hatását az ICM-értékkel jellemezzük, mely az a koncentráció, amely a kontrollakti vitás 50%-ának eléréséhez szükséges. Az IC^-értéket grafikusan határozzuk meg, ahol a %-os gádást az ordinátán, a koncentráció (pM) logaritmusát az abszcisszán tüntetjük fel. A fend kísérleti elrendezésben a Mepacrin foszfolipáz Aj gádási ICjo-értéke 1600 pM. In vitro vizsgálat emberi trombocitákból származó foszfolipáz C gátlásának meghatározására Emberi trombocitákat nyerünk „Buffy coats”-ból frakcionált centrifugál ássál, majd mélyhűtjük. A foszfolipáz C-t a sejtszuszpenzió ultrahangos kezelésével felszabadítjuk, mely 1 órás, 150 000 g-n történő ultracentrifugálás után a felülúszóban oldva található. Az enzimaktivitás meghatározására az enzimet (20- 100 pg protein) pH = 6 értékű 0,025 M trisz/maleát pufferben 5 percen át inkubáljuk, 37 *C hőmérsékleten, 0,2 mM CaCl2 és 0,02 mM radioaktívan jelölt foszfatidil-(14C)-inozit szubsztrát adagolása mellett. A reakciót kloroform-metanol (2:1, tf/tf) eleggyel kirázva állítjuk le, így a nem reagált szubsztrátot a szerves fázisba extraháljuk, míg a reakció során keletkezeit 14C-inozit-foszfát a vizes fázisban marad és az aliquot radiomctriás mérésével meghatározható. A vizsgált anyagok foszfolipáz C-re kifejtett gátló hatásának méréséhez ezeket vízben, dimetil-szulfoxidban (legfeljebb 5 tf/tf%-os oldat) vagy etanolban (legfeljebb 2,5 tf/tf%-os oldat) oldva adjuk az inkubálási elegyhez. A hatóanyagok hatáserősségét az ICjo-értékkel fejezzük ki, mely az a koncentráció, mely a kontroliaktivitás 50%-ának eléréséhez szükséges. Az ICjo-értéket grafikusan határozzuk meg, ahol a %-os gátlást az ordinátán, a koncentráció (pM)logaritmusátazabszciszszán tüntetjük fel. A fenti kísérleti körülmények között a Mepacrin a foszfolipáz C-t 20 pM/ICjo értéknek megfelelően gátolja. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás (I) általános képletű, új szubsztituált alkanofenonok - mely képletben Rí adott esetben fluorozott 1-4 szénatomos alkil-csoport, R2 hidrogénatom vagy adott esetben fluorozott 1-7 szénatomos alkil-csoport, X oxi- vagy tio-csoport, alk 1-7 szénatomos alkilén-csoport, n értéke 1 vagy 2, R3 szubsztituálatlan vagy adott esetben fluorozott 1-4 szénatomos alkil-, 1-4 szénatomos alkoxi-, 1-4 szénatomos alkoxi-karbonil-, karboxil-csoporttal és/vagy halogénatommal szubsztituált fenilcsoport, vagy adott esetben fluorozott vagy karboxil-csoporttal szubsztituált 1-6 szénatomos alkil-csoport vagy 1-4 szénatomos alkoxi-karbonil-(l-4 szénatomos)-alkil-csoport, R4 adott esetben 1-4 szénatomos alkil-csoporttal észterezett vagy benzol-szulfonil-amino-csoportként amidált karboxil-csoport -és sóik előállítására, azzal jellemezve-, hogy egy (H) általános képletű epoxidot - ahol Rlt R2, X, alk, n és R3 az előzőekben megadott jelentésű - egy (ül) általános képletű tiollal - ahol R, a fent megadott jelentésű - vagy ennek valamely sójával reagáltatunk és egy, a találmány szerinti eljárás során nyert vegyületet, amelyben R3 és/vagy R* jelentése 1-4 szénatomos alkoxi-karbonil-csoport, a megfelelő (I) általános képletű vegyületté hidrolizáljuk, amelyben R3 és/vagy R* jelentése karboxil-csoport és/vagy egy találmány szerinti módon nyert szabad vegyületet sóvá, vagy egy találmány szerint kapott sót a szabad vegyületté vagy más sóvá alakítunk. (Elsőbbsége: 1989.03.28.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (1) általános képletű vegyületek és sóik előállítására, mely képletben R, 1-4 szénatomos alkil-csoport és R2 adott esetben fluorozott 1-7 szénatomos alkil-csoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelően szubsztituált kiindulási anyagokat használjuk. (Elsőbbsége: 1988.10.14.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (1) általános képletű vegyületek és sóik előállítására, mely képletben Rí 1-4 szénatomos alkil- vagy mono-, di- vagy poli-fluor-(l-7 szénatomos)-alkil-csoport, X oxi- vagy tio-csoport, alk 1-7 szénatomos alkilén-csoport, R3 szubsztituálatlan vagy 1-4 szénatomos alkil-, 1-4 szénatomos alkoxi-csoporttal, -halogénatommal, karboxil-, 1-4 szénatomos alkoxi-karbonil- és/vagy trifluor-metil-csoporttal szubsztituált fenil-csoport, (1—6 szénatomos)-alkil-, mono-, di- vagy trifluor-(l-6 szénatomos)-aÚtil-, karboxi-(l-6 szénatomos)-alkil- vagy 1-4 szénatomos alkoxi-karbonil-(l-4 szénatomos)-alkil-csoport, és R* karboxil-, 1-4 szénatomos alkoxi-karbonil- vagy N-(benzol-szulfonil)-karbamoilcsoport, azzal jellemezve, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 26
