202761. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabilizált eritropoietin-készítmények előállítására
HU 202761B 7 8 előirata [Exp, Hematol. 11,649-660 (1983)] szerint egér-Iéptesztben vizsgáljuk a következőképpen: Körülbelül 20 g súlyú nőstény B6C3F1 -egerekbe (Zentralinstitut für Versuchstierkunde, Hannover) két egymást követő napon 60 mg/-kgfenü-hidrazin hidrokloridot injektálhatunk intraperitoneálisan. A lépet 3 nap múlva eltávolítjuk, a lépsejtet steril komplett tápoldatban (Dulbecco Modified Eagle’s Medium + 584,0 mg/1 L-glutamin 0 0,1 mmól/1 2 merkapto-etanol+20% borjúmagzatszérum) szuszpendáljuk, és 4xl06 magtartalmú sejt/ml-re hígítjuk. A szuszpenziót, amelyhez előbb hozzáadjuk a vizsgálati anyagot, illetve az EPO-standardot megfelelő koncentrációkban BSA-pufferben oldva, mikroliter lemezeken szétosztjuk (0,2 ml/mélyedés). Inkubálás után (22 óra, 37 *C, levegő ± \5% CO2) mélyedésenként 1 pCi aktivitású 20 pl 3H- metil-timidin oldatot adunk hozá, és újból 2 óra hosszat inkubáljuk 37 ’C-on. Utána a tartalmat egy „cell-harvester” segítségével összegyűjtjük, és desztillált vízzel mossuk. A 3H-timidin beépülését p-szcintülációs számlálóval meghatározzuk, és a standard preparátumokkal szemben kiértékeljük. 5 10 15 20 ’’Working standard”-ként a Genetics Intsitute, Cambridge, Massachusetts, USA „P009-EPOStandard”-ját használjuk, amely 112 egység/ml EPO-t (és 503 ng/ml proteint) tartalmaz. Az EPO-aktivitásukra vizsgálandó liofüizátumokat előbb ampullánként 2 ml injekciós minőségű vízben oldjuk, a további hígítások—éppúgy, mint a „working standard”-nál — BSA-pufferral történnek [8,75 g nátrium-klorid, 1,95 g kalcium-klorid x 2H20,1,00 g BSA (borjú szérumalbumin, a Calbiochem cégtől), injekciós minőségű vízzel 1 literre feltöltve]. A 3H-metü-timidint (fajlagos aktivitás: 2 Ci/mmól) a New England Nuclear-tól szereztük be. 7. példa A 6. példában leírtakhoz hasonló módon egy némileg módosított törzsreceptúrát karbamiddal és különböző aminosavakkal, illetve aminosavkeverékekkel elegyítünk. Összehasonlítás céljából egyidejűleg két mannit-tartalmú receptúrát is vizsgálunk, amelyek a 178 665. számú nyüvánosságra hozott európai szabadalmi leírásnak felelnek meg. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze. 1. táblázat Összetétel 1 819892G a 819893H b 8198941 ab 819895K Eritropoietin 1000 U 1000 U 1000 U 1000 U Karbamid 10,0 10,0 10,0 10,0 Nátrium-klorid 9,0 4,0 9,0 1,0 Tween 20 0,1 0,1 0,1 0,1 Nátrium-dihidrogén-foszfát. H2 0,55 0,55 0,55 0,55 Dinátrium-hidrogén-foszfát. H2 5,0 5,0 5,0 5,0 Kalcium-klorid. 2H2O 0,08 0,08 0,08 0,08 Kollidon 12PF 5,0-5,0-Gelafundin 1,0 1,0-Glicin-15,0-15,0 L-Leucin —-2,0 2,0 L-Izoleucin-2,0 2,0 L-Treonin-0,5 0,5 L-Glutaminsav-0,5 0,5 L-Fenüalanin— 1,0 1,0 Víz, kiegészítve l,0ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml StabUitás 25 “C-on, nap 493 869 934 1128 Stabilitás 0 'C-on, nap 985 1114 1144 1205 2. táblázat Kísérlet száma 895 896 897 898 899 900 901 902 903 Összetétel mg/ml-ben EPO, (P007 sarzs) 250 U 250 U 250U 250 U 250 U 250 U 250 U 250 U 250 U Nátrium-klorid 1,0 1,0 1,0 1,0 1.0 1,0 1,0 1,0 1,0 Tween 20 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Nátrium-dihidrogénfoszfát. H2 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 Dinátrium-hidrogénfoszfát . H2 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Kalcium-klorid. 2H2O 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 Mannit—— — — — _Karbamid-10-10 — 10-10-Glicin-15,0-15-15-15-15 5
