202595. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi alfa-1-foetoproteinnel kapcsolódó egér monoklonális ellenanyag előállítására
3 HU 202 595 A 4 matrix rendszerű kompetíciós vizsgálatban jellemezzük. A kívánt ellenanyagpár kombinációt az eltérő antigéndeterminánshoz kötődő ellenanyagpárok közül úgy választjuk ki, hogy az egyik plasztikfelülethez kötődve, a másik detektáló enzimhez kötve ne veszítse el immunaffinitását. A találmány szerinti eljárás alkalmazása során a hibrid sejtek kolóniái közül nagyobb számú mutat pozitivitást, a specifikus ellenanyagot termelő kolóniák száma lépenként elérheti a 20-at. Mérsékelt számú kísérletből a termelést legjobban szolgáló sejtvonal szelekcióval kiemelhető. Mérsékelt számú kísérletből kiemelhető olyan ellenanyagpár is, melynél egyik a felülethez való kötődés, a másik az enzimes detektálás szempontjai szerint előnyös. A találmány szerint eljárva a felülethez, illetve az enzimhez immunaffinitás-vesztés nélkül kötődő ellenanyagok kiválasztása előtt kompetíciós vizsgálatban megkeressük azokat az ellenanyagpárokat, melyek biztonságosan más-más antigén determinánshoz kötődnek, így egymás reakcióját legkevésbé zavarják. A leírt módon nyert pozitív sejtvonalakkal ellenanyagokat állítunk elő, és ezeket matrix rendszerben páronként egymás után reagáltatjuk az antigén AFP-vel. Ahol a két vizsgált ellenanyag más-más antigéndetermináns helyhez kötődik, a második reakció alacsony kompetencia %-ot mutat, kis mértékű a gátlás. Ahol a két ellenanyag kötőhelye azonos vagy közeli, az első reakció kompetál a másodikkal, a gátlás %-a magas. A találmány szerinti eljárással előállított ellenanyagok általános jellemzői: lg izotípus IgG 1 ill. IgG 2a Titer 10-M0-5 HSA-val adott keresztreakció 0-10%. A találmány szerinti eljárást az alábbi példában részletesen ismertetjük. Példa AxDBA2 keresztezéssel nyert Ft egereket esetenként 10 (lg antigénnel immunizálunk, az első két ciklusban az antigénhez komplett Freund adjuvánst adunk, a 3., 4., 5. ciklusban az antigént inkomplet Freund adjuvánssal visszük be. Az antigén utolsó oltása vizes oldatban történik. Az oltások módja és időpontja az alábbi ciklusos program szerinti: I. táblázat Nap Bevitt anyag Bevitel módja Az oldat térfogata ml 1. ciklus 0 AFP-CFA talppáma ill. hátbőr 0,1 ill. 0,1 2. AFP-CFA talppáma ill. hátbőr 0,1 ill. 0,1 4. AFP-CFA talppáma ill. hátbőr 0,1 ill. 0,1 2. ciklus 10. AFP-CFA hátbőr 0,2 12. AFP-CFA hátbőr 0,2 14. AFP-CFA hátbőr 0,2 3. ciklus 40. AFP-IFA talppáma ill. hátbőr 0,1 ill. 0,1 42. AFP-IFA talppáma ill. hátbőr 0,1 ill. 0,1 44. AFP-IFA talppáma ill. hátbőr 0,1 ill. 0,1 táblázat folytatása Nap Bevitt anyag Bevitel módja Az oldat térfogata ml 4. ciklus 50. AFP-IFA hátbőr 0,2 52. AFP-IFA hátbőr 0,2 54. AFP-IFA hátbőr 0,2 5. ciklus 80. AFP-vizes oldat 84. lép kivétele hasüregbe 0,2 CFA = complet Freund adjuváns IFA = inkomplet Freund adjuváns. A lépsejteket Sp2/oAg-14 jelű egér mielóma sejtekkel ismert módon fuzionáljuk. [1. Andó és munatársai (1984); Tissue Culture and Res., P. Röhlich és E. Bácsi szerkesztők, Academic Press Hungary, Elsevier Press, Holland 241. old.] A hibrid sejteket ismert módon szelektáljuk [Köhler G., Milstein C.: Eur. J. Immunoi., 6, 511 (1976) és Hengartner H., Luzzati A. L., Schreier M.: Curr. Topies in Microbiol, and Immunoi., 81, 92 (1978)], majd ezek közül az antigéntermelőket az alábbi módon meghatározzuk: Mikrotiter lemez lyukaiba 100-100 pl mennyiségű, 3 pg/ml koncentrációjú AFP oldatot pipettázunk és 16 órán át 4 ‘C-on inkubáljuk a lemezeket Az antigént 15 mM Na2C03,35 mM NaHC03 (pH = 9,6) pufféiban hígítottuk. A lemezeket háromszor PBS-Tween» oldattal mossuk, melynek összetétele: 137 mM NaCl, 1,47 mM KH2P04,8 mM Na2HP04,2H20,0,05% Tween», pH = = 7,2. Ezután a tesztelésre kerülő hibridóma felülúszók 100-100 pl-ét 2 órán át 37 *C-on inkubáljuk a lyukakban. A fenti mosást háromszor ismételjük, majd 100- 100 pl hígított nyúl-anti-egér Ig-HRPO-t inkubálunk a lemezeken 37 ‘C-on, 1 órán át (HRPO = tormagyökér peroxidáz). A lemezeket ismét mossuk, végül 200 pl szubsztrát oldatot mérünk a lemez lyukaiba. (A szubsztrát-oldat összetétele: 333 pg/ml o-fenilén-diamin, 0,005% H202, 63 mM Na2HP04.2H20,26,2 mM citromsav, pH=6,0). Az inkubálást 37 'C hőmérsékleten 30 percen át végezzük. A reakció leállítására 50 pl/iyuk 4 n H2S04-et mérünk be, az eredményt spektrofotometriával 492 nm-eft értékeljük. Az antitest termelő hibridómasejteket klónozzuk, egy egér lépsejtjeinek feldolgozása során például 24 ellenanyagtermelő kiónt emelünk ki. A sejtek ellenanyagtermelésének minősítése: A specifikus ellenanyagot termelő sejteket 106 sejt/ml koncentrációban egér hasüregébe oltjuk (1 ml/egér). A tumoros sejtek hatására magas immunglobulin-tartalmú ascites folyadék képződik (5-10 mg specifikus lg egerenként). Az ascites folyadékok munkahígításaként azt a hígítást adjuk meg, ahol enzim-immun tesztben - ELISA tesztben - az illető hígítás mellett az enzimes reakció színes termékének mérőszáma E = 1,0. A tesztben antigénként 3 pg/ml AFP-t alkalmazunk, ehhez adjuk a vizsgált ellenanyagot hígítási sorban, majd egy enzimkötött, detektáló, peroxidázzal jelzett anti-AFP ellenanyagot. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
