202593. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új citotoxinok és ilyeneket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
11 HU 202 593 B 12 magzat szérummal egészítettünk ki, 5 pCi/ml mennyiségű [metil-3-H]-timidin jelenlétében tenyésztettük. A sejt monoréteget kalciumot és magnéziumot nem tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldattal kétszer mostuk a jelzőanyag feleslegének eltávolítására, majd 0,05%-os etilén-diamin-tetraecetsav segítségével a műanyag tálcáról eltávolítottuk. Az így jelzett sejteket ezután Dulbecco módosítású Eagle-féle tápközegben diszpergáltuk, és 200 pl mennyiségeket (mindegyik 104 sejtet tartalmazott) a mikrotitráló tálca 0,3 ml-es lyukaiba szétosztottunk, és nedves inkubátorban 37 *C hőmérsékleten 5% szén-dioxid jelenlétében 18 órán át inkubáltuk. A tápközeget ezután leszívtuk és 250 pl/lyuk mennyiségű hígított mintával pótoltuk két párhuzamos sorban, amelyek azonos log3 hígításokat tartalmaztak. A lemezeket ezután 24 órán át inkubáltuk, majd 1 pg/ml mennyiségben cikloheximidet adtunk hozzá és a lemezeket ismételten további 24 órán át inkubáltuk. A lyukakból ezután 200 pl-es mennyiségben leszívtuk a felülúszót, „Coctail W” szcintillációs folyadékba tettük és folyadék szcintillációs számlálóval számoltuk. A kapott eredményeket a 3. ábrán ábrázoltuk. B) Hőmérséklet hatása a bLT, rTNFa és rTNFß citotoxikus aktivitásra Tisztított bLT mintákat (500 U/ml), amelyeket a 3. példa szerinti Mono Q oszlopról vettünk le 30 percen át különböző hőmérsékleten inkubáltuk, majd az 1. példa szerint LM sejtek és semleges vörös festék alkalmazásával vizsgáltuk. Hasonlóképpen inkubáltuk a rekombináns TNFa (Genzyme Fine Chemicals Ltd., Suffolk, Anglia) és rekombináns TNFß (NIBSC, South Mimms, Potters Bar, Hertfordshire, Anglia) mintákat is. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze. Hőmérséklet Megmaradt citoloxikus aktivitás ("Q bLT rTNFa rTNFß 20 100 100 100 42 100 ND ND 56 100 ND ND 65 100 ND ND 75 81 9 63 80 6,5 5 6 ND = nem vizsgált Az rTNFa és rTNFß-näl feltüntetett eredmények egy mérésből származnak, a 75 °C és 80 "C-os eredmények két vagy három mérés átlagát jelentik, egyébként a többi bLT-vizsgálati eredmény is egy mérésből származik. A 75 ”C-nál kapott eredmények jelentős különbséget mutatnak a bLT, és az rTNFa, ill. rTNFß hőmérsékletstabilitás között. C) Neuraminidáz hatása a bLT és TNFß citotoxikus aktivitására A 3. példa szerinti Mono Q oszlopról nyert bLT mintákat vibrio cholerae-ból (BDH Chemicals Ltd., Poole, Dorset, Anglia) származó neuraminidázzal kezeltünk a következőképpen: 25 pl-es mintákhoz (2500 U/ml) 5 pl neuraminidázt (500 U/ml) adtunk 50 pl 0,1 mólos nátrium-acetát pufféira!, (pH = 5,1) együtt, és 60 percen át 37 °C-on inkubáltuk. Ezután 5 pl 0,2 mólos sialsavat adagoltunk minden mintához az enzim inaktiválására. A térfogatot 0,3 ml-re egészítettük ki 1 % borjúmagzati szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközeggel, majd az 1. példában leírtak szerint LM sejtvonal és semleges vörös festék alkalmazásával meghatároztuk az aktivitást. Az enzim specifitásának ellenőrzésére a vizsgálat előtt neuraminidázt, nátrium-acetátot és 0/2 mólos sialsavat tartalmazó mintákat is inkubáltunk. A kapott eredmények azt mutatták, hogy a bLT aktivitása a neuraminidázzal végzett kezelést követően is teljesen megmaradt. Ez eltér a RPMI 1788 sejtekből származó TNFß-näl megfigyeltektől, amely szerint ezeknél a citotoxikus aktivitás 49%-os, illetve 92%-os csökkenést mutat 0,2, illetve 0,4 egység neuraminidáz jelenlétében (Cancer Research, 1985,45,851-862.) D) Kimotripszin hatása a bLT, rTNFa és rTNFß citotoxikus aktivitására. A 3. példa szerinti Mono Q oszlopról származó bLT mintákat, valamint a fentiek szerinti rekombináns TNFa és rekombináns TNFß mintákat kimotripszin jelenlétében inkubáltuk, hogy ezen enzim emésztő hatásával szembeni viselkedésüket meghatározzuk. A vizsgálatot a következőképpen végeztük: 300 pl-es mintákat (500 U/ml, LM sejtekkel és semleges vörös festékkel az 1. példában leírtak szerint meghatározva) 6 egység kimotripszin (Type I-S; Sigma Chemicals Ltd., Poole, Dorset, Anglia) jelenlétében 2 órán át 37 "C-on inkubáltuk. Ezután minden mintához szójabab tripszin inhibitort adagoltunk (Sigma Chemical Ltd.) a reakció meggátlására. A minták aktivitását ezután LM sejtek és semleges vörös festék alkalmazásával megvizsgáltuk. A kapott eredmények azt mutatták, hogy a bLT és rTNFß aktivitása a kimotripszin hatására nem változik, míg az rTNFa aktivitása a kimutathatósági érték alá csökken (ez 20 U/ml érték). E) Limfoblasztoid interferon hatása a bLT és TNFß citotoxikus aktivitására Az 1. és 3. példa szerinti anti-limfoblasztoid interferon immunoaffinitásos oszlopról származó bLT és a 6A. példa szerint nyert természetes TNFß minták citotoxikus aktivitását vizsgáltuk 0,1-10 000 U/lyuk mennyiségű limfoblasztoid interferon („Wellferon”) jelenlétében, valamint ilyen interferon nélkül. Sejtvonalként L929-et alkalmaztunk és a vizsgálatot a 6A példa szerinti trícium felszabadítás vizsgálat szerint végeztük. A kapott eredményeket a 4. ábrán mutatjuk be. A bLT esetében a citotoxikus aktivitás gátlása nem volt megfigyelhető, míg TNFß esetében 10 U/lyuknál nagyobb koncentrációban jelenlévő limfoblasztoid interferon a citotoxikus aktivitást gátolja. A TNFß-val kapcsolatos eredmény egyezést mutat korábbi megfigyelésekkel (Williams, Lymphokine Research, 1984,3, 113). F) bLT-tartalmú, oszlopról lejövő folyadékok vizsgálata interleukin-1 és y-interferon aktivitásra i) Az 1. példa szerinti anti-limfoblasztoid interferon immunoaffinitásos oszlopról lejövő minta interleukin-1 aktivitását C3H/He comitogenesis vizsgálattal végeztük (Eur. J. Immunoi., 1986, 16, 370-375). Aktivitás nem volt kimutatható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
