202593. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új citotoxinok és ilyeneket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 593 B 2 A találmány tárgya eljárás új citotoxin előállítására limfoblasztoid sejtvonalak táptalajon való inkubálásával és a termelt citotoxin izolálásával. A találmány oltalmi körébe tartozik az így nyert citotoxint hatóanyagként tartalmazó humán és állatgyógyászat területén alkalmazható gyógyszerkészítmények előállítási eljárása is. A citotoxinok az immunrendszer sejtjei által termelt fehérjék, de különböző citotoxinokat egyéb más sejtekből is elő lehet állítani. Különböző egyéb hatásuk mellett ezek a fehérjék képesek tenyészetben rákos daganatok elpusztítására és a két legismertebb citotoxin, a tumor nekrózis faktor TNFa és TNFß (amelyet oc-limfotoxinnak is neveznek) in vivo is tumorellenes hatást mutat. A TNFa-át és TNFß-t egyaránt kódoló cDNS-eket E. coliban klónozták és kifejezték (Pennica és mtsai, Nature, 1984,572,724; Gry és mtsai Nature, 1984,372,721). Egyéb citotoxinokat, így például a természetes pusztító sejt citotoxikus faktort (natural killer cell cytotoxic factor, NKCF) nem jellemezték részletesen (Ortaldo J. R. és mtársai, J. Immunol., 1986, 737, 2857-2863). A találmány szerinti citotoxint - a továbbiakban bázikus limfotoxinnak nevezzük (basic lymphotoxin) és bLT-nek rövidítjük - úgy jellemezzük, hogy daganatellenes hatása van. Különösen hatásos számos emlős sejtvonal ellen, beleértve különösen a humán vastagbél adenocarcinoma HT 29 scjtvonalat (ATCC No. HTB 38) és a humán orrsövény, kvázi-diploid tumor RPMI 2650 sejtvonalat (ATCC No. CCL 30). A találmány szerinti eljárással olyan citotoxint állítunk elő, amelynek látszólagos molekulatömege gélszűréssel meghatározva 47 + 5 kD, látszólagos izoelektromos pontja legalább 7,7 és aminosav-összetétele a következő: Aminosav Maradékok száma Aminosav Maradékok száma Asx 36,0 ±4,3 Pro 24,5 ± 2,9 Glx 46,7 ± 5,6 Tyr 12,3 ± 1,5 Ser 41,0 ±4,9 Val 22,7 ± 2,7 Gly 38,4 ± 4,6 Met 8,4 ± 1,0 His 13,6 ± 1,6 Ile 19,6 ±2,4 Arg 19,6 ± 2,4 Leu 43,1 ± 5,2 Thr 21,4 ±2,6 Phe 23,8 ± 2,9 Alá 33,2 ±4,0 Lys 26,4 ± 3,2 Natív formájában a bLT-nek feltehetően alacsony molekulatömcgű alegységekből álló kvatemer szerkezete van, de ez még nincs bizonyítva. Az Asx, ill. Glx, Asp és/vagy Asn, ill. Glu és/vagy Gin aminosavakat jelent. A találmány szerinti eljárásnál a bLT-t lényegében tömény formában nyerjük, lényegében olyan anyagoktól mentes állapotban, amelyek egyébként természetes környezetükben általában jelen vannak. A kapott bLT tisztasága nagyobb, mint 90%, különösen nagyobb mint 95%. A találmány szerinti eljárással nyert bLT kombináltan több olyan tulajdonsággal rendelkezik, amelyek korábban citotoxinokkal kapcsolatban eddig még nem voltak leírva. A fentiekben említett fizikai-kémiai tulajdonságokon kívül a bLT a következő, a TNFa-tól és/vagy TNFß-tol eltérő biológiai tulajdonságokkal rendelkezik: i) 75 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után nagyobb a citotoxikus aktivitása, mint a rekombináns TNFa-é vagy rekombináns TNFß-6; ii) citotoxikus aktivitását a neuraminidázzal végzett kezelés nem befolyásolja, míg ugyanez a kezelés a természetes TNFß esetében a citotoxikus aktivitás csökkenését jelenti; iii) patkány L929 sejtek (ATCC No. CCL 1) esetében a citotoxikus aktivitást a limfoblasztoid interferon nem gátolja eltérően a természetes TNFß-tol. A találmány szerinti eljárásnál a bLT-t úgy állítjuk elő, hogy a limfoblasztoid sejtvonalat táptalajban inkubáljuk, a sejtvonalat indukálószerrel indukáljuk, majd a bLT-t a táptalajból izoláljuk. A találmány szerinti eljárásnál bármilyen limfoblasztoid sejtvonal felhasználható, de különösen az olyan limfoblasztoid sejtvonal, amely interferon termelésére képes (Strander, H. és mtsai., J. Clin. Microbiol., 1975, 7,116-124 és Christofinis, G. J. és mtársai, J. Gen. Virol, 1981,52,169-171). Az ilyen sejtvonalak könnyen származtathatók Burkitt-féle limfomás betegek sejtjeiből, vagy Epstein-Barr vírus által okozott tumorsejtjeikből. Különösen előnyös származási helye az ilyen sejtvonalaknak egy Namalwa nevű afrikai kislány sejtjei (Klein, G. és mtársai, Int. J. Cancer, 1973,72, 396-408). Az innen származó sejtvonal különösen nagymennyiségű interferont termelt megfelelő stimulálás után (Strander, H. és mtársai, J. Clin. Microbiol., 1975,7,116-117). A sejtvonal másodlagos tenyészete Dr. I. Gresser-től (Villejuif, Franciaország) származott 1975 januárjában. Ekkor a sejtvonalat RPMI 1640 táptalajon (Moore, G. E„ J. Amer. Med. Assoc., 1967, 799, 519-524) 10%-os borjúmagzat szérum jelenlétében való tenyésztéshez adaptálták. A laboratóriumunkban a sejteket a fenti táptalajon, 6-8 hónapos borjúkból származó 5-7%-os szérummal kiegészítve tenyésztettük és másodlagos tenyészeteket készítettünk hetente két vagy három alkalommal 18 hónapon át. Ezen sejtek törzsoldatát Namalwa/WRL- nek neveztük el és ampullákban folyékony nitrogénben tároltuk. A sejtekről kimutattuk, hogy myeoplazma fertőzéstől mentesek és a mintákat az amerikai törzsgyűjteményben ATCC No. CRL 1432 szám alatt letétbe helyeztük. A limfoblasztoid sejtvonal inkubálása és a felhasznált táptalaj a szakterületen általában ismert, és előnyösen azonos az interferon előállításánál alkalmazott eljárással. így a sejteket előnyösen szérum-tartalmú táptalajon 37 °C hőmérsékleten addig inkubáljuk, amíg 0,5-10 x 106 sejt/ml koncentrációt érünk el. Ekkor kívánatos lehet, hogy a sejteket például centrifugálással vagy szűréssel kinyerjük és friss táptalajban rcszuszpendáljuk. Ez előnyösen növeli a sejtsűrűséget kisebb mennyiségű táptalaj felhasználásával (ily módon fokozva a bLT-kihozatalt is) és/vagy megkönnyíti a bLT tisztítását kevesebb szérumot vagy szérumot nem tartalmazó táptalaj alkalmazásával. Ipari méretekben ez az utólagos lépés azonban még nincs bizonyítva. Szérum-tartalmú táptalajként például RPMI 1640 táptalajt alkalmazunk 1—10 tf% borjú vagy ló-szérummal kiegészítve. Egy szérummentes erős RPMI 1640 tápközeget (táptalajt) például a következőkkel egészítünk ki: 1 mmól glutamin 0,5 tf% tripton 3,5 mg/ml glükóz 1 mg/1 inzulin 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
