202591. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a BU-3420T antibiotikum, valamint ilyen antibiotikumot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
17 HU 202 591 B 18 2. példa BU-3420T elkülönítése és tisztítása Az összegyűjtött 220 liter térfogatú fermcntlevet (lásd az 1. példát) 6 n sósavoldattal 2,0 pH-ra állítjuk, 80 liter n-butanolt adunk hozzá, és az elegyet 2 órán át keverjük, majd a keveréket szerves és vizes fázisra különítjük egy Sharpless centrifugával (a Kokusan cég 4A jelű gyártmánya). A 68 liter térfogatú szerves kivonatot azeotróposan betöményítjük vákuumban (alkalmailag vizet adunk hozzá), s így 1 liter vizes koncentrátumot kapunk. A leülepedett csapadékot dekantálással elkülönítjük, 2 liter metanolban oldjuk, és a vizes szűrlettel egyesítjük. Az egyesített oldatot Diaion HP-20 oszlopra töltjük (a Mitsubishi Kaséi cég gyártmánya, 010 x 65 cm), amelyet 70%-os vizes metanollal előkezelünk. Előbb 80%-os vizes metanollal mossuk, majd az aktív terméket 80%-os vizes acetonnal eluáljuk. Az eluátumot 120 ml-enként frakciókba gyűjtjük, és ezeket papírlemezen, tesztorganizmusként Bacillus subtilis PCI 219 alkalmazásával vizsgáljuk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, és vákuumban bepároljuk. így 62 g sötétbarna, olajszerű maradékot kapunk, amelyet Sephadex LH-20 oszlopon (04 x 40 cm) kifejlesztő oldószerként metanolt alkalmazva kromatografálunk. Az eluátumot egyrészt biológiai vizsgálattal (B. subtilis PCI 219), másrészt vékonyréteg-kromatografiával (VRK-val) szilikagélen vizsgáljuk (kifejlesztőszerként xilol/metil-etil-keton/metanol 5:5:1 térf./térf. arányú elegyét alkalmazva az Rrérték 0,40); az aktív frakciókat vákuumban bepároljuk, s így 56 mg sötétkék, szilárd anyagot kapunk, amelyet preparatív vékonyréteg-kromatográfiával szilikagélen (Kieselgel 60 Fz*, Merck) tovább tisztítunk, a kromatogramm kifejlesztésére xilol/metil-etil-keton/metanol 5:5:1 térf./térf. arányú elegyét használjuk. A lemezről a 0,40 Rrértékkel jelentkező kék csíkot lekaparjuk, és dioxánnal extraháljuk. A kivonatot bepárolva, 5,7 mg egységes, kék színű BU-3420T terméket kapunk, melynek fizikai-kémiai tulajdonságai az előzőekben ismertetett adatoknak felelnek meg. 3. példa A fermentációs eljárás előnyös kiviteli módja A) Fermentáció rázólombikban Micromonospora chersina M956-1 törzset (ATCC 53710) kémcsövekben lévő, élesztőt és malátakivonatot tartalmazó agar-táptalajra viszünk. A közeg 1,0% malátakivonatot, 0,4% élesztőkivonatot, 0,4% dextrózt, 1,5% agar-agart és 0,15% kalcium-karbonátot tartalmaz desztillált vízben. A ferdeagar táptalajt az oltvánnyal együtt 2 hétig 28 ‘C hőmérsékleten inkubáljuk. Termelés céljára alkalmas inokulum előállítása céljából a ferdeagar-tenyészet felületi részét 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba visszük át, amelybe 100 ml, 1,0% laktózt, 3,0% dextrint, 1,0% hallisztet, 0,5% kalcium-karbonátot, 0,6% réz-szulfátot és 1 mg/liter nátrium-jodidot tartalmazó desztillált vizes, steril közeget helyeztünk, a vegetatív tenyészetet 28 'C-on 7 napig 250 fordulat/perc sebességű forgó-rázóasztalon inkubálunk. Az így kapott vegetatív tenyészetből (üledéke 8%, pH-értéke 7,5) 5 ml-t 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 100 ml termelőközegbe viszünk át, amely 1,5% keményítőt, 0,5% glükózt, 1,0% cukorrépa-melaszt, 1,0% hallisztet, 0,5% kalcium-karbonátot, 0,005% réz-szulfátot és 5 mg/liter nátrium-jodidot tartalmaz desztillált vízben. A termelőközeget 4-6 napon át 250 fordulat/perc sebességű forgó-rázóaszutalon inkubáljuk. így a HPLC-elemzés alapján 120-144 óra alatt 4,5-5,0 pg/ml antibiotikum termelődik. B) Fermentáció tartályban 5 ml fagyasztott, M956-1 (ATCC 53710) törzsből származó vegetatív tenyészetet használunk 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 100 ml olyan vegetatív közeg (a továbbiakban: VM-1) oltására, amely 1% laktózt, 3,0% dextrint, 1,0% hallisztet, 0,5% kalcium-karbonátot és 0,6% kalcium-szulfátot tartalmaz. A vegetatív közeget 5 napig 28 ‘C-on 250 fordulat/perc sebességű forgórázóasztalon inkubáljuk. Az így kapott tenyészetből (10% üledék, pH-értéke 7,1) 25 ml-t 2 literes Vitro-edénybe viszünk át, amelybe 500 ml, 1,5% keményítőt, 0,5% glükózt, 1% cukorrépa-melaszt, 1% hallisztet és 0,5% kalcium-karbonátot desztillált vízben tartalmazó vegetatív közeget (a továbbiakban VM-2) helyeztünk. E vegetatív közeget 96 órán át 28 *C-on 250 fordulat/perc sebességű forgó-rázóasztalon inkubáljuk. Az így kapott tenyészetet (üledéke 12%, pH-értéke 7,4) aszeptikusán egy New Brunswick Microgen fermentorba visszük át, amely 10 liter termelőközeget tartalmaz. A termelőközeg 1,0% keményítőből, 0,5% Pharmamedia-ból, 0,1% kalcium-karbonátból, 0,005% réz-szulfátból, 0,5 mg/liter nátrium-jodidból és desztillált vízből áll. A mikroorganizmust az alábbi paraméterek megtartásával tenyésztjük: a keverő fordulatszáma 250 fordulat/perc, a hőmérsékletet 30 ‘C-ra szabályozzuk, és percenként 10 liter levegőt vezetünk be. Az antibiotikum termelése 96-110 óra után éri el a maximumát, amely a HPLC- elemzés alapján 2,8 |ig/ml. Egy másik kísérletünkben 5 ml fagyasztott, M956-1 (ATCC 53710) törzsből származó vegetatív tenyészetet oltunk Erlenmeyer-lombikban lévő 100 ml VM-1 vegetatív közegbe. E vegetatív közeget 28 ‘C-on 5 napon át 250 fordulat/perc sebességű forgó-rázóasztalon inkubáljuk. Az így kapott tenyészetből (üledéke 10%, pH-értéke 7,1) 70 ml-t Vitro-edényben lévő 1400 ml VM-2 vegetatív közegbe viszünk át, és 28 ‘C-on 96 órán át 250 fordulat/perc sebességű forgó-rázóasztalon inkubáljuk. Az így kapott vegetatív közeget aszeptikusán 50 liter névleges térfogatú Biolofitte fermentorban lévő 30 liter termelőközegbe visszük át, amely 1,5% keményítőt, 0,5% glükózt, 1,0% cukorrépa-melaszt, 1,0% hallisztet, 0,5% kalcium-karbonátot és 5 mg/liter nátrium-jodidot tartalmaz desztillált vízben. A habzás gátlására habzásgátló szert alkalmazunk. A mikroorganizmust az alábbi paraméterek megtartásával tenyésztjük: a keverő fordulatszámát 250 fordulat/percre, a hőmérsékletet 30 *C-ra szabályozzuk és 10 liter/perc sebességgel levegőztetünk. Az antibiotikum termelése a HPLC-elemzés alapján 120-144 óra alatt érte el a 2,4 pg/ml maximális értéket. 4. példa Az elkülönítés és tisztítás előnyös kiviteli módja A BU-3420T antibiotikumnak a főmenüéből történő kinyerésére és tisztítására lényegesen egyszerűsített eljárást dolgoztunk ki, amelyet a következő vázlattal szemléltetünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
