202591. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a BU-3420T antibiotikum, valamint ilyen antibiotikumot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
21 HU 202 591 B 22 jük. A szuszpenzióhoz 4 nagy merítőkanálnyi (körülbelül 2 kg) Dicalite-t keverünk cs az így kapott keveréket kosaras centrifugán szűrjük. A szűrletet az egymással nem elegyedő két fázisra hagyjuk elkülönülni, majd a fázisokat elválasztjuk. Az etil-acetátos fázist vákuumban forgóbepárló készülékben bepárolva 84,2 g sötétkékeszöld A maradékot kapunk. Az A maradék kromatografálása Dicalite-on 84,2 g fenti A maradék, 200 ml kloroform és 100 g Dicalite összekeverésével 500 ml-es gömblombikban pépet készítünk. Alapos átkeverés után a pépet vákuumban forgóbepárlón szárazra pároljuk. Az így kapott maradékot száraz állapotban „flash” kromatográfiás oszlopra visszük (amelynek belső átmérője 4,1 cm, hossza 46 cm). Az eluálást 21 kPa nitrogénnyomással kezdjük, és a következő eluáló sorozatot alkalmazzuk: 3 liter hexán, 1 liter toluol és 1 liter metanol. A toluolos eluátumot forgóbepárlón vákuumban szárazra párolva 214,2 mg B maradékot kapunk. A B maradék kromatografálása Sephadex LH-20-on Spectrum Liquid chromatography típusú oszlopot (amelynek belső átmérője 2,5 cm, hossza 70 cm) 80 g Sephadex LH-20 géllel töltünk (előállítója a Pharmacia Fine Chemicals, N. J.), amelyet előzőleg 24 órán át 500 ml 1:1 térf./térf. arányú kloroform-metanol eleggyel duzzasztottunk. Az oszlopot az ágyra számítva háromszoros térfogatú eluálószerrel éjszakán át egyensúlyozzuk, utána a fenti B maradékot 10 ml 1:1 térf./térf. arányú kloroform-metanol elegyben oldva az oszlop tetejére visszük, és az eluálást 1,5 ml/perc áramlási sebességgel, a mozgó fázissal kezdjük. 260 ml kezdeti előfrakció után 86, egyenként 10 ml térfogatú frakciót gyűjtünk. Minden egyes frakcióból 2-3 pl térfogatú alikvot részt VRK segítségével vizsgálunk. A 25-40. frakciókat összegyűjtjük és vákuumban bepároljuk. így 7,3 mg C maradékot kapunk. A C maradék vákuumban végzett folyadékkromatográfiája Zsugorított Büchner üvegszűrőt (Kontes Scientific Classware K-954100 Büchner tölcsér, átlagos pórusmérete 10-15 mikron, 15 ml térfogatú) 4 cm magasságig VRK-minőségű száraz szilikagéllel (Silica Gel 60, cat #7730, E. Merck, Darmstadt, NSZK) töltünk. Az adszorbenst a gravitáció hatása alatt enyhe kopogtatással ülepedni hagyjuk, majd vákuum alkalmazásával egyenletes, tömött, kemény masszát kapunk. A vákuumot megszüntetjük és az adszorbensre 30 ml kloroformot öntünk, majd ismét vákuumot adunk a rendszerre, és az oszlopot szárazra szivatjuk. 7,3 mg tömegű C maradékot kis mennyiségű szilikágélen előzetesen adszorbeálunk és egyenletes eloszlásban az oszlop tetejére visszük. Az eluálást enyhe vákuumban kezdjük, és az alábbi eluáló sorozatot alkalmazzuk: 500 ml kloroform, 200 ml, 2% metanolt tartalmazó kloroform, 200 ml, 3% metanolt tartalmazó kloroform, és 200 ml, 5% metanolt tartalmazó kloroform. A 2% metanolt tartalmazó és a 3% metanolt tartalmazó kloroformos frakciók a VRK-elemzés alapján egyetlen bíborvörös foltot adnak, amelynek Rfértéke 0,35. E frakciókat összegyűjtjük és vákuumban bepároljuk. így 1,3 mg BU-3420T antibiotikumot kapunk. A BU-3420T Fizikai és kémiai tulajdonságai A fentiek szerint izolált BU-3420T fizikai és színképi jellemzői az alábbiak: Külleme: amorf, bíborszínű, szilárd Analízise vékonyréteg-kromatográfiával: Oldószerrendszer Rrérték Kloroform/metanol 9:1 0,35 Kloroform/metanol 5 :1 0,54 Xilol/metil-etil-keton/metanol 5:5:1 0,53 UV színképe: Hivatkozási szám: 8727115 Hewlett Packard 8452A Diode Array spektrofotométer Koncentráció: 1,25 x 103 g/100 ml Oldószer metanol K» (El* Semleges 597 nm 112 568 nm 118 395 nm 64 285 nm váll 238 nm 342 A HPLC-elemzés: Mozgó fázis Retenciós idő 55% 0,1%-os ammónium-acetát oldatot és 45% tetrahidrofuránt tartalmazó elegy 5,4 perc SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás az (I) képletű BU-3420T antibiotikum előállítására, azzal jellemezve, hogy a Micromonospora chersina ATCC 53710 törzset, vagy annak valamely variánsát vagy mutánsát asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó vizes tápközegben, merített kultúrában, aerob körülmények között tenyésztjük majd a BU-3420T-t a tenyésztőközegből elkülönítjük. 2. Eljárás antibakteriális, gombaellenes és daganatgátló hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított (I) képletű BU-3420T antibiotikumot a gyógyszerkészítésben szokásos hígító-, vivő- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 12
