202590. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-treonin előállítására
1 HU 202 590 B 2 A találmány tárgya eljárás L-trconin előállítására az Escherichia nemzetséghez tartozó és ciszteinre vagy cisztinre vagy analógjaira rezisztens és L-treonin termelésére képes mikroorganizmusok segítségével. Az L-treonin olyan aminosav, amely nemcsak gyógyszerként használható, mint aminosav-készítmény, hanem állati takarmányhoz is használható adalékként Ez ideig különböző eljárások ismeretesek L-treonin fermentációval való előállítására; például egy olyan eljárás, amely az Escherichia nemzetséghez tartozó és borrelidinre szenzitív mikroorganizmust alkalmaz (6752/76 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés), az Escherichia nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus diamino-pimelinsavat és metionint igényel, és amelynek treonin-bioszintézis rendszere rezisztens treonin visszacsatolásos inhibiciójára (10037/81 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés), a Serratia nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus treonin - dehidrogenáz hiányos és rezisztens treonin metabolizmus antagonistákra (48195/77 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés), a Corynebacterium nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus rezisztens a-amino-ß-hidroxi-valeriänsavra és S-(2-amino-etil)-L-ciszteinre és metionint igényel (19087/72 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés), a Brevibacterium nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus rezisztens a-amino-p-hidroxi-valcriánsavra és S-(2-amino-etil)-L-ciszteinre és leucint igényel (31093/75 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés), a Brevibacterium nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus rezisztens a-amino-p-hidroxi-valeriánsavra és S-(2-amino-etil)-L-ciszteinre és L-izoleucint és L-lizint igényel (224684/83 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés) és az Escherichia nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus a rifampicin, lizin, metionin, aszparaginsav és homoszerin közül legalább egyre rezisztens, vagy csökkent az L-treonint lebontó képessége (273487/88 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés). A jelen találmány szerint L-treonin magas kitermeléssel termelhető az Escherichia coli fajhoz tartozó egyik olyan mikroorganizmus táptalajban való tenyésztésével, amely mikroorganizmus rezisztens ciszteinre vagy cisztinre vagy ezek analógjaira és képes L-treonin termelésére, amíg az L-treonin felhalmozódik a fermentlében, és onnan kinyerhető. A jelen találmány szerinti eljárásban bármely mikroorganizmus felhasználható, amennyiben az Escherichia coli fajhoz tartozik, rezisztens ciszteinre vagy cisztinre vagy ezek analógjaira, és képes L-treonint termelni. Cisztein és cisztin előbb említett analógjaira példaként S-metil-cisztein, S-etil-cisztein, allil-glicin, homocisztcin, cisztin-hidroxamát, ciszteinsav és homociszteinsav említhető. A ciszteinre vagy cisztinre vagy analógjaikra rezisztens mutáns törzs egy Escherichia coli fajhoz tartozó és L-treonint termelő mikroorganizmus szokásos mutációs technika segítségével ciszteinre vagy cisztinre vagy analógjaikra való rezisztenciával történő felruházásával nyerhető. Az előnyös mutáns törzsekre példaként Escherichia coli H-7256, Escherichia coli H-7263, Escherichia coli H-7293 és Escherichia coli H-7294 említhetők. Az Escherichia coli fajhoz tartozó és L-treonint termelő mikroorganizmusok előnyösek abból a szempontból, hogy más aminosavakat melléktermékként csak csekély mennyiségben termelnek. Az előbb említett mutáns törzsek előállítására szolgáló eljárás egy speciális példáját a leírás következő részében adjuk meg. Escherichia coli H-4258-at (FERM BP-985), amely diamino-pimelinsavat és metionint igényel és rezisztens a-amino-ß-hidroxi-valeriän savra és rifampicinre, 30 *C-on 30 percig kezelünk 200 pg/ml N-metil-N-nitro-N’-nitrozo-guamidinnel (NTG). A kezelt sejteket 1 g/litcr cisztein-hidroxamátot tartalmazó minimál táptalajra [5 g/liter glükóz, 1 g/liter amónium-szulfát, 2 g/liter kálium-dihidrogén-foszfát, 7 g/liter dikálium-hidrogén-foszfát, 0,1 g/liter magnézium-szulfát-víz (1/7), 20 mg/liter vas(III)-szulfát, 50 mg/liter diamino-pimelinsav, 50 mg/liter metionin és 20 g/liter agar, pH 7,2] leoltjuk, és 30 "C-on 2-6 napig tenyésztjük ezen a táptalajon növekedésre képes cisztin-hidroxamát rezisztens mutánsok telepeinek nyerése céljából. Utána 50 mutáns törzset felszedünk, és L-treonin termelési vizsgálatnak vetjük alá. Szelektáltunk egy olyan mutánst, amely a H-4258- cnál magasabb L-treonin-termelőképességgel rendelkezik. A szelektált törzset Escherichia coli H-7256-nak neveztük. A fentiekhez hasonló módon szelektáltunk 0,5 g/liter allil-glicinre, 5 g/liter ciszteinre, illetve 5 g/liter cisztinre rezisztens mutánsokat, azzal az eltéréssel, hogy cisztinhidroxamát helyett allil-glicint, ciszteint, illetőleg cisztint használtunk, és a mutánsok az Escherichia coli H-7263, H-7293, illetve H-7294 nevet kapták. Az így nyert H-7256, H-7293 és H-7294 törzseket 1988. november 8-án letétbe helyeztük a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japánnál a Budapesti Egyezménynek megfelelően a FERM BP-2137, FERM BP-2138, FERM BP-2139, illetőleg FERM BP-2140 számokon. Az 1. táblázat az előbb említett szülő törzs (H-4258 törzs) és a mutáns törzsek növekedését szemlélteti, amikor a tenyésztést 24 óra hosszat 30 ‘C-on ciszteint vagy 1. táblázat Koncentráció (g/liter) Törzs növekedése H-7256 H-7263 H-7293 H-7294 H-4258 Adalék nélkül 0 ++ ++ ++ ++ ++ Cisztin-hidroxamát 0,05 ++ — — — — Allil-glicin 0,05-++Cisztein 5-++ — -Cisztin 5-++ ++: megfelelő növekedés nincs növekedés 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
