202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
27 HU 202 587 B 28 vábbá a teljes trp D polipeptidet tartalmazza, az összes, a trp promoter-operátor rendszer szabályozása alatt áll. AzE.coliK12W3110tna2trp-A102/pGMl törzset az alábbi törzsgyűjteményben helyeztük letétbe: ATCC 31622 sorszámon, American Type Culture Collection. A sejtekből a pGMl ismert módon izolálható. 20 pg plazmidot PvuII restrikciós enzimmel emésztünk, az enzim a plazmidot öt ponton hasítja. A génfragmenscket ezután EcoRI linkerekkel kombináljuk (ez komplementer oligonukleotidokból áll, szekvenciája a következő: pCATGAATTCATG), ami által EcoRI helyet tartalmazó plazmidba való, klónozásra használható EcoRI restrikciós enzim által felismerhető helyet juttatunk a fragmensbe. A pGMl plazmidból kapott 20 pg-nyi mennyiségű dczoxi-ribonukleinsav fragmenseket 10 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal kezeljük 20 pmól 5’-foszforilezeu, alábbi szekvcnciájú szintetikus oligonukleotid jelenlétében: pCATGAATTCATG. A reakciót 20 pl alábbi összetételű T4 dczoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban végezzük 4 ‘C hőmérsékleten, egy éjszakán át: 20 mmól/1 trisz, pH = 7,6, 0,5 mmól/1 adenozin-trifoszfát, 10 mmól/1 magnézium-diklorid és 5 mmól/1 ditio-treitol. Az oldatot 10 percen át 70 'C hőmérsékleten tartjuk a ligálási reakció leálh'tására. A linkereket EcoRI enzimmel hasítjuk és az EcoRI végekkel rendelkező fragmenseket 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel különítjük el. A három legnagyobb fragmenst izoláljuk a gélről úgy, hogy először etidium-bromiddal festjük, majd ultraibolya fényben lokalizáljuk a fragmenseket, végül kivágjuk a gélről a számunkra érdekes részeket. 300 pl 0,1 x TBE-oldatban szuszpendáljuk a gélfragmenseket, és dialízis zsákban elektroforézist végzünk 1 órán át 0,1 x TBE-pufferban, 100 V feszültségkülönbség mellett. A TBE-puffer összetétele a következő: 10,8 g trisz-bázis, 5,5 g bórsav, 0,09 g dinátrium-etilén-diamino-tetraecetsav, *11 vízben. A dialíziszsákból összegyűjtjük a vizes oldatot, fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, és az oldat nátrium-klorid koncentrációját 0,2 mólra állítjuk be. Ezután etanolos kicsapással kinyerjük a dczoxi-ribonukleinsavat. Az EcoRI ragadós végekkel rendelkező trp promoter/operátor rendszert tartalmazó fragmenseket úgy azonosítjuk, hogy beépítjük egy tetraciklin-érzékeny plazmidba, amely a promoter/operátor rendszer beépülése következtében tetraciklin rezisztenssé válik. Az összes dezoxi-ribonukleinsav fragmenst a továbbiakban poliakril-amid gél-clektroforézissel és elektroelucióval izoláljuk. B) A trp promoter/operátor rendszer által szabályozott, tetraciklin rezisztenciát kifejező pBRH trp plazmid kialakítása és az A) pontban izolált, trp promoter/operátor rendszert tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav fragmens azonosítása és sokszorosítása ApBRHl plazmid [Rodriguez és munkatársai, Nucleic Acids Research, 6,3267-3287 (1979); ATCC 37070 jelű törzs] ampicillin antibiotikummal szembeni rezisztenciát fejez ki, és tartalmazza a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gént, de nem áll promoter szabályozása alatt, így nem határozza meg ténylegesen a reisztenciát. A plazmidot hordozó sejtek azért tetraciklinre érzékenyek. Az EcoRI helyre promoter/operátor rendszert juttatva, a plazmid tetraciklin-rezisztenciát fog meghatározni. A pBRHl plazmidot EcoRI enzimmel emésztjük. Az enzimet fenolos extrakcióval távolítjuk el, majd kloroformmal extrahálunk és a dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapást követően vízben oldjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat egy másik reakcióelegyben, az 5. példa A) pontja szerint előállított három dezoxi-ribonukleinsav firagmenssel kombináljuk, és az előzőekben megadottak szerint eljárva, T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal Egáljuk mindhármat. A reakcióelegyben lévő dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K12 294 (NRRL B-15625) sejteket transzformálunk, ismert módon [Hcrshficld és munkatársai, Proc. Nat Acad. Sei. USA, 71,3455-3459 (1974)] és a baktériumokat LB táptalajra [Maniatis és munkatársai (1982), lásd előbb] szélesztjük, a táptalajhoz pedig előzőleg 20 pg/ml ampicillint és 5 pg/ml tetraciklint adtunk. Több tetraciklinre rezisztens telepet szelektálunk, és izoláljuk belőle a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, amit pBRH trp jellel jelölünk. Több tetraciklinre rezisztens telepet szelektálunk, és a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izoláljuk belőlük, majd pBRHtrp jellel jelöljük. A kívánt fragmens jelenlétét restrikciós enzimes analízissel bizonyítjuk. A pBRHtrp plazmid ß-laktamäz enzimet fejez ki, ez felelős az ampicillin-rezisztenciáért A plazmid tartalmazza a trp promoter/operátor rendszert hordozó dezoxi-ribonukleinsav fragmenst. A dezoxi-ribonukleinsav fragmens kódolja továbbá az előproteint (LE’), meghatározza a trp vezető protein első 6 aminosavából és a trpE polipeptid utolsó harmadából álló fúziós fehérjét, meghatároz továbbá egy második proteint (D’ jellel jelöljük), amely megfelel a trp D polipeptid első felének. A plazmid által meghatározott harmadik protein a tetraciklin rezisztenciát kódoló gén által leírt fehérje. C) A pSOM7A2 plazmid előállítása A pBRHtrp plazmidot EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztjük, és a kapod fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és azt követő elektroelucióval izoláljuk. Az izolált fragmenst a pSOMl 1 plazmid [Itakura és munkatársai, Sei., 198,1056 (1977); 4 366 246 számú amerikai és 2 007 676A nagy-britanniai szabadalmi leírásrác] EcoRI emésztést követően kapott lineáris fragmensével keverjük. A keveréket T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal Egáljuk, és a kapott dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K12 294 sejteket transzformálunk, az előzőekben megadottak szerint eljárva. A transzformáns baktériumokat ampicillint tartalmazó lemezeken szelektáljuk, és a kapott ampiciUinre rezisztens telepeket telephibridizációval vizsgáljuk [Gruenstein és munkatársai, Proc. NaL Acad. Sei., USA 72,3951-39655 (1975)]. A pBRHtrp plazmidból izolált trp promoter/operátor rendszert tartalamzó fragmenst P32 izotóppal radioaktívan jelezzük, és a fenti hibridizációkor próbaként használjuk. Több telep pozitív a telep-hibridizációs kísérletekben, és ezért szelektálj uk azokat Izoláljuk a sejtekből a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat és a beépült fragmensek orientációját BglII és BamHI restrikciós enzimekkel végzett kettős emésztést követően analizáljuk. A trp promoter/operátor rendszert hordozó fragmenst 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
