202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
23 HU 202 587 B 24 Az eleggyel E. coli JA221 sejteket transzformálunk, és a kapott, a pNM789 plazmidot tartalmazó transzformánsokat ampicilin rezisztencia alapján szelektáljuk. A pNM789 plazmid (7. ábra: 117) azonosítását a 494 bázispárból álló PvuII és a 109 bázispárból álló Xbal-PvuII fragmensek jelenlétének bizonyításával végezzük. E) A pNM789B plazmid végső előállítása A 8. ábra 117 számmal jelzett pNM789 plazmidja egyetlen aminosavat meghatározó kodonnal különbözik a teljes szarvasmarha növekedési hormon kodonjától. A cserét úgy végezzük, hogy a pNM789 plazmid 28 bázispárból álló PvuII-BamHI fragmensét eltávolítjuk, és helyettesítjük az alábbi szekvenciájú szintetikus, kétszálú fragmenssel (8. ábra: 118): 5 ’-CTGTGCCTTCTAG-3 ’ 3 ’-GAC ACGG AAG ATCCTAG-5 ’ 10 pG pNM789 plazmidot egy egység PvuII enzimmel kezelünk 200 pl PvuII pufferban 5 percen át 37 *C hőmérsékleten. 10 percen át 65 °C-on tartjuk az elcgyet, majd 300 pl végtérfogatra hígítjuk BamHI puffer adagolásával. A fragmenseket 10 egység BamHI enzimmel teljesen emésztjük 1 órán át 37 °C hőmérsékleten, majd 5 egység alkalikus foszfatázzal lehasítjuk a foszfátcsoportokat 1 órán át 65 *C-on végzett reakcióval. A kapott dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen különítjük el, és ismert módon tisztítunk egy olyan dezoxi-ribonukleinsav fragmenst, amely megfelel a pNM789 plazmid egyetlen helyen hasított lineáris alakjának (8. ábra: 119). 0,2 pg így izolált fragmenst 5 pmól szintetikus fragmenssel Egálunk 2 egység T4 ligázzal katalizált reakcióban 20 pl ligáz puffénál készült reakcióelegyben. A ligálást 4 "C hőmérsékleten végezzük egy éjszakán át. Transzformációt követően több plazmidot izolálunk és vizsgálunk a 494 bázispárttól álló PvuII és a 628 bázispárból álló Xbal-BamHI fragmens jelenlétére. A fenti fragmenseket tartalmazó plazmidok megfelelnek a pNM789B plazmidnak (8. ábra: 120). 2. példa A pCZIOl plazmid és az E. coli K12 RV308lpCZ101 törzs előállítása A) A pIM-V -A3 plazmid izolálása Az E. coli K12/pIM-I’-A3 (NRRL B-15733) baktériumot TY táptalajban tenyésztjük. A táptalaj összetétele a következő: 1% tripton, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% nátrium-klorid, pH = 7,4. A táptalaj 50 pg/ml kanamicint is tartalmaz. A tenyésztést ismert módon végezzük, 25 *C hőmérsékleten. 1:10 arányban friss táptalajjal hígítjuk a tenyészetet, és 3 (kán át 37 ”C hőmérsékleten inkubálunk, majd 0,5 ml tenyészetet 1,5 ml térfogatú Eppendorf csőbe adagolunk. 15 másodpercen át centrifugálunk. Ha másként nem adjuk meg, az összes lépést szobahőmérsékleten végezzük. A kapott felülúszót óvatosan eltávolítjuk egy pipettával, és a sejtüledéket 100 pl alábbi összetételű, frissen előállított lizozimos oldatban szuszpendáljuk: 2 mg/ml lizozim, 50 mmól/1 glükóz, 10 mmól/1 diamino-tetraecetsav és 25 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,0. Az elegyhez 200 pl alkalikus nátrium-lauril-szulfátoldatot adunk (0,2 n nátrium-hidroxid, 1% nátrium-lauril-szulfát), majd enyhén rázzuk az elegyet, és lízisig 0 °C hőmérsékleten tartjuk (körülbelül 5 perc). Ezután 150 pl 3 mólos nátrium-acetát-oldatot adagolunk, és néhány másodpercen át forgatva a csövet óvatosan keverjük annak tartalmát. Legalább 60 percen át 0 ’C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, és ezután 15 percen át centrifugáljuk, amikor majdnem teljesen tiszta felülúszót kapunk. A felülúszót egy másik centrifugacsőbe öntjük, majd 3 térfogatnyi hideg, abszolút etanolt adunk hozzá. 5 percen át szárazjég és etanol keverékében tartjuk a centrifugacsövet, majd a kivált csapadékot 5 percen át centrifugálva elkülönítjük, és a felülúszót óvatosan leszívjuk. Az összegyűjtött csapadékot 100 pl alábbi összetételű TE elegyben oldjuk. Ennek összetétele a következő: 10 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, 1 mmól/1 etilén-diamin-tetraecetsav. Az elegy tartalmazza a pIM-I’-A3 jelű plazmid dezoxi-ribonukleinsavat. B) A pNM789B plazmid emésztése Xbal-BamHI enzimekkel, és a 0,6 kb nagyságú Xbal-BamHI fragmens előállítása 5 pg pNM789B dezoxi-ribonukleinsavat oldunk 50 pl alábbi összetételű Hi-só pufferban. Ennek összetétele a következő: 100 mmól/1 nátrium-klorid, 20 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, 10 mmól/1 magnézium-diklorid és 5 mmól/1 ß-merkapto-etanol. Az oldathoz 10-10 egység BamHI és Xbal restrikciós enzimet adunk, és 1 órán át 37 *C hőmérsékleten inkubálunk. 5 pl, 7,0 pH-jú, 3 mólos nátrium-acetát-oldattal leállítjuk a reakciót, majd 2 térfogatnyi abszolút etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat. Az emésztett terméket 100 pl TE pufferban oldjuk, és felhasználásig 0 *C hőmérsékleten tároljuk. C) A plM-V -A3 plazmid Xbal-BamHI emésztése Az emésztést a 2. példa B) pontja szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pNM789B plazmid helyett a pIM-I’-A3 plazmidot használjuk. Az előállított dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl TE pufferban oldjuk, és felhasználásig 0 *C hőmérsékleten tároljuk. D) Ligálás és transzformálás 1 pgpIM-I’-A3 emésztett plazmidot, 1 |igpNM789B plazmid Xbal-BamHI fragmenst, 40 pl vizet és 5 pl, 5 mmólos adenozin-trifoszfát-oldatot, továbbá 5 pl alábbi összetételű ligációs elegyet állítunk elő, és 5 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal egészítjük ki. A ligációs elegy összetétele a következő: 500 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,8, 200 mmól/1 ditio-treitol, 100 mmól/1 magnézium-diklorid. A reakciót 2 órán át 20 ‘C hőmérsékleten végezzük. 2 percen át 65 ‘C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, jégfíirdőben lehűtjük és Wensink módszere szerint [Cell., 3, 315 (1974)] transzformáljuk az E. coli K12 RV308 sejteket A baktériumokat TY lemezen növesztjük, ennek a táptalajnak az összetétele a következő: tripton 1%, élesztőkivonat 0,5%, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
