202586. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz-rezisztens urokináz és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
5 HU 202 586 B 6 nizálunk, az immunizált állatnak elkülönítjük a lép sejtjeit, a sejteket fuzionálva hibridomákat hozunk létre, és megvizsgáljuk a fúziós tenyészet felülúszójának antiprotcolitikus aktivitását A szkrinelést végezhetjük például úgy, hogy a szóban forgó ellenanyagot egyes szálú 5 uríkonázzal inkubáljuk, majd az inkubálást plazminnal, tripszinnel vagy bármely más szóbajöhető protcázzal folytatjuk. Ezután proteáz inhibitort adunk hozzá, hogy megállítsuk a reakciót, és a fragmentumokat gél elektroforézissel elkülönítjük. Összehasonl ítva az elcktrofo- 10 rézis gélen végzett redukcióval illetve anélkül kapott eredményeket megállapíthatjuk, hogy az ellenanyag megvédte-e az egyes szálú urikonázt, azaz egy az egyes szálú urikonázból álló sáv jelenléte a redukáló gélen szemléltetni fogja az egyes szálú urikonáznál tapasztalt 15 védettség mértékét. Egy másik megoldás szerint az egyes szálú urikonázt a konverziós helyen, előnyösen a LUK helyen kovalensen módosítják úgy, hogy csökkentsék a hajlamot a protcolitikus hasadásra. A kovalens módosítás általá- 20 ban kétféle módon történhet. Az egyik megoldás szerint az egyes szálú urikonázt egy származékképzésre alkalmas vegyülcttel reagáltatjuk mindaddig, míg egy jelentős populációból legalább egynél a lánckonverziós vagy LUK helyén lévő urikonáz és egy szerves moleku- 25 la kovalensen kapcsolódik, vagy a szerves molekula úgy kapcsolódik az urikonázhoz, hogy a LUK vagy konverziós helyet szlérikusan gátolja. A reakciókörülmények egyszerű mátrix kísérletben határozhatók meg, amelyben az urikonáz plazminogén aktivitásának meg- 30 őrzésiét vizsgáljuk a protcolitikus rezisztenciával összehasonlítva. Alkalmas reagnesek olyan monofunkcionális vegyületek, amelyek az alkalmazott körülmények között maximálisan szelektívek az arginin oldalláncra, és előnyösen a lizin maradékokra, beleértve az 1,2-cik- 35 lohexán-diont, az ecetsav-anhidridet és a fenil-glioxált. A nem kívánatos származékok keletkezése az urikonáz aktív helyein és a „kringle” szerkezet kialakulása minimalizálható, ha a reagáltatást sztöchimetrikus feleslegben lévő plazminogénnel (vagy egyéb szubsztráttal 40 vagy szubsztrált analóggal) és fibrinnel vagy benzamidinncl végezzük. Miután a reagens monofunkciós, térhálósodásától nem kell tartani. A találmány szerinti, proteáz-rezisztens egyes szálú urikonáz előállításának előnyös módja azonban az, hogy rekombináns módszerekkel változást hozunk létre az aminosav szekvenciában a lánc konverziós és kívánt esetben LUK helyeken. Az egyes szálú urikonázt kódoló DNS szekvencia ismert, és imsertek azok a módszerek is, amelyekkel rekombináns gazdasejtekben expresszióval létrehozható (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés; Heyneker H. et al. Functional Expression of the human urokinase gene in Escherichia coli in „Genetics of Industrial Microorganisms, 1982, Proceedings of the IVth International Symposium” K. Ikeda et al Eds. 214-221 1983). Önmagukban ismertek azok a módszerek is, amelyekkel olyan mutációk hozhatók létre ebben a DNS-ben, amelyek proteolízis-rezisztens aminosavszekvencia változatokként fejeződnek ki. Például, restrikciós endonukleázokkal végzett fokozatos emésztéssel a lánc konverziós és LUK helyeket (szükség esetén pedig ezekkel szomszédos tartományokat) kimetszük az urokinázt kódoló DNS-ből (a metszést a proteolízis helyeket kódoló DNS mellett végezve, melyet DNS szekvencia analízissel határozunk meg). Egy megfelelően kimetszett DNS-t elkülönítünk (gél szűréssel meghatározva), egy a kívánt aminosav szekvenciát és szomszédos régiókat tartalmazó oligonukleotidot szintetizálunk, ugyanazokkal a restrikciós enzimekkel emésztjük, amelyeket a nem kívánt fragmentum kimetszésére is használtunk, és ezáltal kohéziós végeket hozunk létre, és a szinteükus DNS-t az egyes szálú urokináz Struktur gén maradékához ligáljuk. A LUK helyet kódoló DNS-t például a pUK54trp207-l Mstl-el és Ball-el végzett részleges emésztéssel metsszük ki, kinyerjük a vektor fragmentumot és újból felépítjük a vektort úgy, hogy ezt a fragmentumot egy a kívánt szekvenciával rendelkező szintetikus oligonukleoüddal ligáljuk. Ennél a megvalósítási módnál humán urokinázt kódoló DNS-t (Lys135—>A) úgy hozunk létre, hogy az MdtI és Ball tcrminálisoknál egy a következő szekvenciával rendelkező oligonukleotidot építünk be: p GCAGATGGAAAGCCCTCCTCTCCTCCAGAAGAATTAAAATTTCAGTGTGG CGTCTACCTTTCGGGAGGAGAGGAGGTCTTCTTAATTTTAAAGTCACACCP 530 582 (A szekvencia alatt megadott számok megfelelnek az 1. ábrán feltüntetett számoknak.) Hasonlóan, a lánc konverziós helyeket kódoló DNS- t például úgy metsszük ki, hogy az urokináz DNS-t Ball 50 és EcoRI enzimekkel részlegesen emésztjük, az előbb megadott módon, majd a felnyitott génbe olyan oligonukleoüdot ligálunk, amely a kívánt aminosav maradékokat kódoló alap szekvenciával rendelkezik. Illusztrációképpen feltüntetjük egy olyan oligonukleotid szekvenciáját, amely a humán urokináz (Arg156-»AHis; Lys,5g—>A) létrehozásában alkalmazható:-HisPhelle-p CCAAAAGACTCTGAGGCCCCACTTTATTATTGGGGGAG GGTTTTCTGAGACTCCGGGGTGAAATAATAACCCCCTCTTAAp 583 627 Más variáns szekvenciákat úgy hozhatunk létre, hogy analóg módon megfelelő oligonukleotidokal szin- 60 tetizálunk és építünk be. Általában azonban egyszerűbb az urokináz DNS mutációval történő módosítása, az Ml 3 fág mutagenezis módszer felhasználásával [Adelman, J. et al. In Vitro Deletional Mutagenesis for Bacterial Production of the 20 000-Dalton Form of Human Pituitary Growth Hormone. „DNA” 2(3): 183-193 1983]. Ez a módszer önmagában ismert. Az aminosav szekvencia mutánsokat az jellemzi, hogy a proteáz helyeken található maradékokat deléció-4
