202586. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz-rezisztens urokináz és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
1 HU 202 586 B 2 Az urokináz (E. C. 3. 4. 21. 31.) egy szerin proteáz, amely a plazminogént plazminná aktiválja. A protein számos szövetben szintetizálódik, beleértve a belhámot (endotherium) és a vesét, és nyomnyi mennyiségben a vizeletben ürül. A tisztított urokináz két aktív formában létezik, egy nagy molekulatömegű formában (HŰK, körülbelül 50 kilodalton) és egy kis molekulatömegű formában (LUK, körülbelül 30 KD). Mindkét humán forma teljes aminosav szekvenciája meghatározásra került (Gunzlcr, W. A. és mtsai: The primary structure of high molecular mass urokinase from human urine: The complete amino acid sequence of the A chain. „Hoppc- Seyler’s Z. Physiol. Chem. Bd.” 363:1155-1165 1982; Steffens, G. J. és mtsai: The complete amino acid sequence of low molecular mass urokinase from human urine. „Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. Bd.” 363: 1043-1058 1982; 92 182 sz. közzétett európai szabadalmi bejelentés). A LUK-ról kimutatták, hogy a HUK-ból származik egy a lizin 135 utáni kötésproteolilikus bontásával, ez felszabadítja a HŰK első 135 aminosavát (Gunzler, W. A. és mtsai: The primary structure of high molecular mass urokinase from human urine: The complexe amino acid sequence of the A chain. „Hoppe-Scylcr’s Z. Physiol. Chem. Bd.” 363: 1155-1165 1982). Szakmai körökben elterjedt vélemény szerint a HUK-ot vagy LUK-ot proteolitikusan aküv formában kell hozni egy egyes szálú, prourokináznak is nevezett prekurzor lizin 158 és izoleucin 159 közötti proteolitikus hidrolízisével ahhoz, hogy a kettős szálú aktivált formához jussunk (amely vagy a HUK-nak vagy a LUK-nak felel meg továbbra is). Az ebből a hidrolitikus kezelésből származó proteolitikusan aktív urokináz speciesek két olyan aminosavláncot tartalmaznak, amelyeket egyetlen diszulfid kötés kapcsol össze egymással. Az aktivációs kapcsolással keletkező két lánc közül az egyiket A-val vagy Argyel jelöljük (attól függően, hogy HUK-ról vagy LUK-ról van szó), míg a másik lánc a B lánc, amely a molekula proteáz tartományát tartalmazza. Az urokináz hatékony trombolitikus reagensnek bizonyult Mivel azonban a természetben csak nyomnyi mennyiségben termelődik, az enzim előállításának költségei igen magasak ahhoz, hogy hatékony alkalmazására lehessen gondolni. Az urokinázt rekombináns DNS technikával is szintetizálták és ismert urokinázt kódoló DNS, valamint az alkalmas vektorok és gazdamikroorganizmusok (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés; Hcyneker H. et al.: Functional Expression oí the human urokinase gene in Escherichia coli in „Genetics of Industrial Microorganisms, 1982, Proceedings of the IVth International Symposium” K. IKeda et. al. Eds., 214-221 1983). Mint már említettük, feltételezték, hogy a plazminogén aktivátorok proteolitikusan inaktív zimogének formájában léteznek, amelyeket proteolízissel „aktiválni” kell mielőtt az enzim a plazminogénre hatna, hogy beindítsa a fibrinolitikus kaszkádot (Wun, T. C. et al. A Proenzyme Form of Human Urokinase, „Jorunal of Biological Chemistry” 257: 7262-7268 1982; Nielsen, L. S. et al. Purification of Zymogen to Plasminogen Activator from Human Glioblastoma cells by Affinity Chromatography with Monoclonal Antibody. „Biochemistry” 21: 6410-6415 1982). Míg megfigyelték, hogy az urokináz egyes láncú proenzim erős aktivitást mutat a zimografikus és fibrinolitikus folyamatokban (Wun. T. C. et al. A Proenzyme Form of Human Urokinase. „Journal of Biological Chemistry” 257: 7262-7268 1982; 4 381 346 sz. USA-bcli szabadalmi leírás), az a tény, hogy a proenzim csak kis aktivitást mutat alacsony molekulatömegű szintetikus polipeptideken, arra a következtetésre vezetett, hogy a proenzim készítményekben található szennyező akü'v (kettős láncú) urokináz nyomok vagy a fibrin lemez vizsgálatokban használt plazminogénben található plazmin nyomok a felelősek a prourokináz fibrinolitikus aktivitásáért (Wun, T. C. et al. A Proenzyme Form of Human Urokinase. „Journal of Biological Chemistry” 257: 7262-7268 1982). Ebből viszont arra a következtetésre lehet jutni, hogy az egyes szálú urokinázt kettős láncú formában kell hozni annak érdekében, hogy képes legyen a plazminogén hasítására, és a fibrinolízis in vivo elindítására. Az urokináz szerepe a vérrögök feloldásában in vivo meglehetősen bonyolult. A prourokinázról feltételezik, hogy a plazmán belül egy inhibitorral lép kölcsönhatásba. Úgy gondolják, hogy a fibrin távolítja el ezt az inhibitort, miután a prourokináz felszabadul a plazminogén hatás céljára [Zamarron et al. Competitive inhibition by Human Plasma of the Activation of Plasminogen by Pro-Urokinase in „Thrombosis and Haemostasis” 54 (1): abs. 604, pp 102, July 14, 1985]. Nem teljesen világos, hogy vajon önmagában az inhibitor eltávolítása elegendő-e a plazminogén hidrolízis kiváltásához, vagy az inhibitor eltávolítása egyszerűen kedvez a szokásos kettős láncú formájú urokináz kialakításának. Nem ismert, hogy az urokináznak mely része kötődik az inhibitorhoz, és ugyancsak ismeretlen a kötés mechanizmusa. Egy további bonyolult hipotézis az urokináznak egy fibrin-megkötő képességet tulajdonít a HŰK species-hcz, különösen a 49 és 132 helyek közötti tartományhoz (Hcyneker, H. et al. Functional Expression of the human urokinase gene in Escherichia coli in „Genetics of Industrial Microorganisms, 1982, Proceedings of the IVth International Symposium” K. Ikeda et al Eds., pp 214-221 1983). E hipotézis viszonya az inhibitor posztulátumhoz, és ezek egymáshoz viszonyított értéke egyelőre ismeretlen. A kettős láncú urokináz vérrögök kezelésére való felhasználásának egyik komoly akadálya, hogy a kettős láncú formát nyilvánvalóan nem köti meg a prourokináz feltételezett inhibitora. Ha a kettős láncú urokinázt perifériásán adagoljuk, ennek következtében az képes lesz a plazminogén aktiválására a keringési rendszer bármely pontján, ami nem kívánatos mellékhatásokhoz vezet. A kettős láncú urokináz, amely az egyes láncú urokináz plazmin hidrolízisével keletkezik a vérrög helyén, ugyanezekkel a negatív mellékhatásokkal jut be a keringési rendszerbe, különösen a szisztemikus fibrinogenolízis és az al anti-plazmin kiürülése említendő. Ezek a mellékhatások akadályozzák a megfelelő trombogenezist in vivo. Szükség van tehát egy javított formájú egyes láncú urokinázra, amely (a) képes akár a fibrin akár a feltételezett inhibitor megkötésére, azaz amely végül lényegében ugyanúgy funkcionál, mint a natív prourokináz a vérrög keletkezésének helyén mutatott plazminogén aktiváció szempontjából, (b) amely ellenáll a proteolitikus emésztésnek, különösen a kettős láncú formában történő átalakításnak, és (c) amely minimális vagy semmi antigén hatást nem mutat a kezelt betegekben. Mindezeket és egyéb a területen jártas szakember 5 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
