202583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás, reagenskombináció és KIT nukleinsavak vizsgálatára
13 HU 202 583 B 14 helyét a vírus genomon a 3. ábrán mutatjuk be. A nukleotid-szekvenciákat az 5. táblázatban adjuk meg. Az oligonukleotidokat standard módszerekkel szintetizáljuk automatizált berendezésben. A befogó primer biotinilezéséhez az oligonukleotidokat az 5’-végükön animáljuk a szintézis során az Aminolink reagens alkalmazásával (Applied Biosystems). Az aminocsoportokat szulfo-NHS-biotinnel (Pierce Chemical Co.) biotinilezzük, majd a biotinilezett primereket HPLC-vel tisztítjuk reverz fázisú C-18 oszlopon. A használt detektor próbák 41 nukleotid hosszúak, és 32p(dTTP)-vel jelezzük őket DNS-polimeráz alkalmazásával, egy 20-tagú prímerről induló primer extenziós módszerrel [Syvänen et al., Nucleic Acids Research, Jó, 11 327-11 338 (1988)]. A többszörözési reakciót 100 pl térfogatú reakcióclegyben végezzük, amely mindegyik printerből 1 pmólt, a négy dezoxinukleotid-trífoszfát mindegyikéből 200 pmólt, valamint 10 mmól TRIS-HCl-t (pH = 8,8), 50 mmól KCl-t, 2,5 mmól MgCl2-t, 0,1 mg/ml zselatint és 0,1% Tritox X-100-at tartalmaz. A reakcióclegyet, beleértve a templát DNS-t is, 5 percig forraljuk. 2,5 egység Thermus aquaticus DNS-polimerázt adunk hozzá (Promega). Az elegyet paraffinolajjal fedjük be. A reakciókat 20 ciklusban játszatjuk le egy automatizált hő-ciklus berendezésben (Perkin-Elmer/Cetus). A ciklusok paraméterei: denaturálás 45 másodpercig 96 *C- on, illesztés 2 percig 55 ‘C-on, majd primer extenzió 3 percig 72 ‘C-on. A végső ciklus után a hőmérsékletet 10 percig 72 ‘C-on tartjuk. A megsokszorozott célmolekula egytized részét (10 pl) használjuk a hibridizációs reakcióban. A hibridizációs oldat (50 pl) összetétele a következő: 0,6 mól NaCl, 1 mmól EDTA, 20 mmól Na-foszfát (pH = 7,5), 0,02% szarvasmarha szérumalbumin, FicollR, polivinilpirrolidon, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), majd körülbelül 3 x 10s cpm a 32p-vel jelzeu detektor próbából. A hibridizációs reakciót két órán át hagyjuk 65 ‘C-on lejátszódni. A hibridizálás után 20 pl 5 t%-os avidinnel borított polisztirol részecskéket (0,77 pm, Baxter Healthcare Corporation) adunk a reakcióelegyhez. A befogó reakció 30 percig játszódik le szobahőmérsékleten. A részecskéket centrifugálással gyűjtjük össze, majd háromszor mossuk 50 ‘C-on 1 ml következő összetételű oldattal: 1,5 mmól Na-citrát, 15 mmól NaCl, 0,2% SDS. A részecskékhez kötődött hibridek radioaktivitását Cserenkov számlálóval mérjük. Ennek a kísérletnek az eredményeit (2. táblázat) hasonlítjuk két referencia módszerhez, amelyeket az alábbiakban ismertetünk. Az eredmények megegyeznek a referencia módszerekkel kapott eredményekkel, a 14. minta kivételével, amely ismételten a legerősebb jelet adta a sorozatban. A hibás negatív eredményeket, amelyek a vérben lehetséges DNS-polimeráz-inhibitorok következményei, aß-globin génre specifikus primer-párral végzett sikeres amplifikálással zárjuk ki [Saiki et al., Science, 230,1350-1354 (1985)]. Az eredményeket a következő referencia módszerekhez hasonlítottuk: A HÍV szerkezeti fehérjéi elleni antitesteket rekombináns HÍV antitest enzim immunesszével mutattuk ki (Abbou, Organon), valamint immunblottal [Ránki et al., Clinical Experimental Immunology, 69, 231-239 (1987)]. A perifériás vér mononukleáris sejtjeiből (PBMC) a HTV izolálását Asjő és munkatársai módszerével végeztük [Lancet, 2, 660-662 (1986)], és a HÍV p24 antigén (Abbott, Organon) reverz transzkriptáz aktivitásának a tenyészet felülúszójából való kimutatásával igazoltuk. 5. táblázat Vírus Primer/ Nukleotid szekvencia (5 ’-3 ’) /Próba HIV-1 SK 38* ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT SK 39 TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC SK 19 ATCCTGGATTAAATAAAATAGTAAGAA TGTATAGCCCTAC *Kwok et al., J. Virol., 61,1690-4 (1987) 6. táblázat Minta sorszáma HIV-1 ß-globin Szerológia Vírus izolálás Összegy. eredmény radioakt. (cpm) Összegy. Eredmény radioakt. (cpm) 11 5465 + 54269 + + + 12 6289 + 39821 + + + 13 458-47228 + ND 14 33942 ++ 52808 + ND 15 1986 + 50997 + + 16 1079 + 54039 + + + 17712 + 41646 + + + 18 93 — 45109 + ND 19 27-42965 + ND ND - nem detektálható SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás nukleinsavak vizsgálatára és kimutatására hibridizációval, azzal jellemezve, hogy i) a detektálandó cél-nukleinsavat primer-függő polimerizációs reakcióban lemásoljuk, amelyben legalább egy detektor próbát vagy legalább egy befogó próbát használunk módosított printerként, amely beépül a cél-nuk- Ieinsavról készített másolatokba, majd ii) az említett nukleinsav másolatokat hagyjuk hibridizálni egy szelektív detektor próbával vagy egy szelektív befogó próbával, ifi) az így keletkező hibrideket a befogó próbák segítségével elválasztjuk, és iv) a hibrideket a detektor próba segítségével kimutatjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a befogó próbát egy affinitás-párnak legalább egyik tagjával látjuk el, vagy legalább egy olyan specifikus hellyel, amelyhez egy affinitás-párnak legalább egyik tagját lehet hozzákapcsolni. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a detektor próbát legalább egy detektálható jelzéssel látjuk el, vagy legalább egy olyan specifikus hellyel, amelyhez legalább egy detektálható jelzést hozzá lehet kapcsolni. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
