202582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési faktorok előállítására
13 HU 202 582 B 14 II. táblázat folytatása 20 25 30 * 35 * * Szarvasmarha Val-Cvs-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phc-Ser-Arg-Pro-Scr-Scr -Arg-Ilc-Asn-Arg-Arg-Ember Val-Cys-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Ser-Arg-Pro-Ala-Ser -Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Patkány Val-Cys-Ser-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Ser-Arg-Pro-Ser-GIy/Ser-Arg-Ala-Asn-Arg-Arg-40 45 50 55 Szarvasmarha Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Glu-Cys-Cys-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu-Ala-Leu-Leu-Glu-Thr-Ember Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Glu-Cys-Cys-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu-Ala-Lcu-Leu-Glu-Thr-Patkány Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Glu-Cys-Cys-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu-Ala-Leu-Leu-Glu-Thr-Szarvasmarha Ember Patkány 60 65 Tyr-Cys-Ala-Thr-Pro-Ala-Lys-Ser-Glu-COOH Tyr-Cys-Ala-Thr-Pro-Ala-Lys-Ser-Glu-COOH Tyr-Cys-Ala-Thr-Pro-Ala-Lys-Ser-Glu-COOH A csillaggal jelölt bIGF-II csoportok különböznek a humán IGF-II megfelelő részeitől. Az aláhúzott bIGF-II csoportok különböznek a patkány IGF-II megfelelő részétől. 2. példa Ez a példa a bIGF-II-nek a patkány L6 mioblaszt sejtosztódási vizsgálatban való hatékonyságát mutatja be. Részletesebben, az 1. példában leírt MPLC-csúcs anyagát hasonlítjuk össze az Amgen Inc. (Thonsand Oaks, CA) kereskedelmi forgalomban kapható emberi IGF-I preparátumával, hogy kimutassuk e vizsgálatban az előbbi fiziológiai aktivitását. A Yaffee által leírt patkány L6 mioblasztokat Kotts leírása (10. és 11. sz. irodalom) szerint használjuk. Valamennyi inkubációt 37 °C-on 10% C02 és 100% páratartalom mellett végezzük. A sejtszámoláshoz C-1000 Channelyzer (Coulter Electronics, Nialeah, FL)-rcl felszerelt Coulter Counter (Model ZM)-t használunk. A tárolandó tenyészeteket 10% (tf%) borjúmagzati szérumot (FCS médium) tartalmazó Dulbecco-féle Minimum Essential Medium (DMEM) [Grand Island Biological Corp. (GIBCO), Grand Island, N.Y.]-on tartjuk fenn, és rendszerint 1200 sejt/cm2 vagy 600 sejt/cm2 sejtsűrűségben lemezeljük, majd 3 illetve 4 napi tenyésztés után oltjuk át. Az átoltás során 3 ml 0,05% (vegyes%) tripszint (GIBCO) tartalmazó mosó pufferoldattal (0,8%, vagyes%) NaCl, 0,04% (vcgycs%) KC1, 0,1% (vegyes%) dextróz, 0,058% (vegyes%) NaNC03, 0,02% (vegyes%) EDTA, pH = 7,4 5 percig 37 'C-on inkubáljuk a tenyészeteket, majd a tripszinizációt 7 ml FCS tápoldat hozzáadásával állítjuk meg. A vizsgálatra felhasználandó (teszt) tenyészeteket a következőképpen készítjük: a tárolt tenyészeteket tripszinizáljuk, a sejteket összegyűjtjük, majd a kapott szuszpenzióban megszámoljuk a sejteket. A kapott szám alapján FCS tápoldaltal a megfelelő koncentrációig hígítjuk, majd gyorsan 25 cm2-es tenyészedényekre lemezeljük a sejteket, 600/cm2 sejtsűrűségi értékkel. A lemezelés után 24 órával a tápoldatot eltávolítjuk és a sejteket szérummentes DMEM-mel mossuk. Ezután minden lenyészedényhez 4 ml tesztoldatot adunk, és további 24 óráig inkubáljuk a tenyészetet, majd a tenyészközeget friss táptalajjal helyettesítjük. A tenyészetet további 48 órán át inkubáljuk, majd sejtszámolást végzünk. A sejtszámoláshoz eltávolítjuk az oldatot, a sejteket 2 ml mosó pufferoldattal mossuk, 1 ml tripszinoldatot adunk hozzá, majd 5 percig 37 ’C-on inkubáljuk a 25 sejteket. A reakciót 3 ml hideg FCS tápoldat hozzáadásával állítjuk meg. A sejtek leválásának meggyorsítása érdekében a tenyészedényeket tízszer megütögetjük, majd egyenes állásba fordítva jégfürdőbe helyezzük, míg a tartalmukat a jégfürdőben lévő üvegcsövekbe 30 lehet átönteni. Minden tenyészedényt 2-3 ml hideg, 0,9% (vegyes%) NaCl-oldattal mosunk, és a mosófolyadékot a sejtszuszpenzióhoz adjuk. Valamennyi csövet ötször óvatosan vortexeljük, hogy a sejtek összetapadását megszüntessük, majd a csövek sejttartalmát Coulter 35 Counter segítségével számoljuk. A tesztkultúrákhoz használt tápoldat készítésekor a vizsgálandó mintát 2% (tf%)-os FCS tápoldattal a megfelelő koncentrációig hígítjuk. Az 1. példában leírt MPLC-csúcs liofilizált anyagát 30 mM trisz-NCl, pH = 40 7,4 (trisz-puffer-oldat)-ban oldjuk 2,6 pM-os becsült koncentrációban. Az 1. számú vizsgálatban ezen oldat 0,2 mi-ét adjuk 19,8 ml 2% FCS tápoldalhoz (26 mM végkonccntráció), 0,22 p pórusátmérőjű szűrőn (Millipore Corp., Bedford, Mass.) átszűrve sterilezzük, és így 45 adjuk a kísérleti tenyészethez. Kontrollként 0,2 ml triszpuffer-oldatot tartalmazó oldatot adunk, és ezt használjuk fel az összehasonlításra. A 2. számú vizsgálatban a MPLC-ről származó anyag oldatának 0,2 ml-ét adjuk 9,8 ml (tf%)-os FCS tápoldathoz (52 mM becsült vég- 50 koncentráció), a fentiek szerint szűrünk, majd kísérleti tenyészethez adjuk. A Tris-pufferoldatot tartalmazó kontrollt hasonlóképpen készítjük. Valamennyi kezelés pozitív kontrollja KP9 M emberi IGF-I (Amigen Biologicals, Thousand Oaks, CA), lásd 55 Kotts és munkatársai munkáját A liofilizált IGF-I-et 44 mM NaNC03 oldatban, pH = 7,4 100 pg/ml koncentrációig hígítjuk. A 10 8 M-os törzsoldat készítésekor 0,015 ml IGF-I-et adunk 20 ml 2% (tf%)-os FCS tápoldathoz. A 10"9 M eléréséhez a törzsoldat 2 ml-ét adjuk 60 18 ml 2%-os FCS tápoldathoz, szűrve sterilezünk, és így adjuk a kísérleti tenyészetekhez. E tenyészeteknél kontrollként 2% (tf%)-os FCS tápoldatot használunk. A 3. számú vizsgálatban az 1. példában leírt MPLC csúcs anyagát 20%-os ecetsavban oldjuk 165 pM be- 65 csült koncentrációig. Két törzsoldatot készítünk. 8
