202581. lajstromszámú szabadalom • Eljárás értékes fehérjeanyagok előállítására rekombináns Bombyx mori polihedrózis vírus DNS alkalmazásával
1 HU 202 581 B 2 A találmány tárgya eljárás például gyógyszerként használható anyagok géntechnológiai módszerekkel való előállítására, közelebbről olyan eljárás, amellyel ezek az anyagok a hagyományos módszereknél hatékonyabban állíthatók elő. Pontosabban a találmány tárgya eljárás ilyen anyagok in vitro vagy in vivo előállítására, vírusból származó DNS felhasználásával. Egy további vonatkozás szerint a találmány tárgya eljárás különböző értékes anyagok hatékony, in vivo, selyemhernyóban (Bombyx móri) történő előállítására, a nukleáris polihcdrózis (sokszög-magvúság) vírusa alkalmazásával. Ugyancsak a találmány tárgyát képezik az említett eljárások végrehajtásában használható vektorok és rekombináns vírus DNS-ek, valamint az ilyenek előállítására irányuló eljárások. Számos eljárás ismeretes értékes anyagok Escherichia coliban, Bacillus subtilisben, Saccharomyces cerevisiaeban slb. való előállítására, plazmidok és hasonlók felhasználásával és a rckombináns DNS technikák igénybevételével. Ismeretes egy olyan közlemény is, amely kísérleteket ír le beta-interferon és beta-galaktozidáz sejtienyészetben (Spodoptera frugiperda-Dól származó stabilizált sejtvonallal) való előállítására, vírus DNS (az Autographa California! nukleáris polihcdrózis vírusának DNS-e) felhasználásával, miután ebben strukturális gcnhclyettesítést hajtottak végre (G. E. Smith et al. Molecular and Cellular Biology 3, 12, p. 2156-2165, 1983; G. D. Pennock el al. ugyanitt, 4,3, p. 399-406,1984). Nehézséget jelent azonban, hogy az A. califomica, amelyet az eljárás végrehajtása során alkalmazni kell, a természetben előforduló kártevő. Ezért ez az eljárás nem megfelelő értékes anyagok előállítási módszereként. A feltalálók vizsgálatokat végeztek abban az irányban, hogy továbbfejlesztett módszert találjanak értékes anyagok előállítására, és megalkották a jelen találmányt. A találmány tárgya tehát eljárás értékes anyagok - így fehérjék vagy glukoproteinek - géntechnológiai módszerekkel való előállítására, a Bombyx móri nukleáris polihcdrózis vírusa (a továbbiakban rövidítve BmNPV) DNS-ének alkalmazásával. Közelebbről: a találmány tárgya olyan eljárás értékes anyagok hatékony előállítására, amely a következőkkel jellemezhető: a BmNPV DNS promoter tartománya funkciójának igénybevétele; a BmNPV DNS-éből exogén génekkel való rekombináció segítségével - ezek kódolják az értékes anyagok termelését - leszármaztatott rekombináns DNS-ek felhasználása és az ilyen rekombinációhoz használható rekombinációs vektorok alkalmazása. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy transzfekciós eljárás; ennek során a BmNPV-vel kombinálva egy rekombináns transzfer vektort alkalmazunk, amely a következőket tartalmazza: egy 5’-felszálló BmNPV DNS fragmentum - amely eredetileg felszálló irányban található a poliéderes fehérje strukturális génjéhez képest és magában foglalja a strukturális génre vonatkozó promoter tartományt; egy transzlációs start kodon és egy, az értékes anyag termelését kódoló exogén (azaz idegen) gén; valamint adott esetben egy 3’-leszálló BmNPV DNS fragmentum, amely eredetileg a poliéderes fehérje strukturális génjéhez képest leszálló irányban fordul elő. A találmány tárgya továbbá: eljárás értékes anyagok előállítására azzal jellemezve, hogy vagy rekombináns BmNPV-t képezünk oly módon, hogy sejttenyészetet vagy egy élő selyemhernyót beoltunk egy rekombináns transzfer vektor és BmNPV DNS keverékével - és ily módon a rekombináns BmNPV-t alakítjuk ki a sejtekben vagy az élő szervezetekben -, vagy sejttenyészetekcl vagy élő selyemhernyókat ugyanígy egy rckombináns BmNPV-vel oltunk be - ezt úgy alakítottuk ki, hogy egyesített DNS-t hoztunk létre a BmNPV DNS-ből és egy Escherichia coli plazmidból - pl. a pBR322-ből -, majd a poliéderes fehérje strukturális génjét - amely a rckombináns DNS-ben található - kicseréljük az értékes anyag termelésének megfelelő génnel, vagy valamilyen más megfelelő eljárással hozzuk létre a rekombináns BmNPV-t és a rekombináns BmNPV-t elszaporítjuk a sejtekben vagy az élő szervezetben. A találmány, egyik foganatosítási módja szerint, olyan eljárást jelent értékes anyagok előállítására, amely a következőkkel jellemezhető: sejttenyészetben vagy egy gazdaszervezetben (különösen egy stabilizált Bombyx móri scjtvonalban vagy egy élő selyemhernyóban) elszaporítunk egy rekombináns Bombyx móri nukleáris polihcdrózis vírust (BmNPV); ezt egy kettős spirál DNS-scl való rekombinációval állítottuk elő, amely DNS a következőket tartalmazza: egy 5’-felszálló BmNPV DNS fragmentum - amely eredetileg felszálló irányban helyezkedik cl a poliéderes fehérje strukturális génjéhez képest, és még tartalmazza a strukturális génre vonatkozó promoter tartományt-, egy transzlációs start kodon, egy - az értékes anyag termelését kódoló - gén és adott esetben egy 3’-Icszálló BmNPV DNS fragmentum, amely eredetileg leszálló irányban helyezkedett el a poliéderes fehérje strukturális génjéhez képest Egy másik foganatosítási mód szerint a találmány tárgya eljárás egy olyan vektor előállítására, amely a következőket tartalmazza: egy 5’-felszálló BmNPV DNS fragmentum - amely eredetileg felszálló irányban helyezkedik el a poliéderes fehérje strukturális génjéhez képest, és még tartalmazza az említett strukturális génre vonatkozó promoter tartományt, és egy 3’-leszálló BmNPV DNS fragmentum, amely eredetileg leszálló irányban helyezkedik cl a strukturális génhez gépest, valamint egy olyan, az előbbiek szerinti vektor előállítására, amelyben az 5’-felszállö DNS fragmentumot egy transzlációs start kodon és egy, az értékes anyag termelését kódoló gén követi. Egy további foganatosítási mód szerint a találmány tárgya eljárás értékes anyagok termelésére azzal jellemezve, hogy a BmNPV DNS-ből kiiktatjuk a poliéderes fehérje szerkezeti génjét - a strukturális génhez képest felszálló irányban elhelyezkedő 5’-felszálló szakasszal együtt, ideértve a strukturális génre vonatkozó promoter tartományt és a strukturál is génhez képest leszálló irányban elhelyezkedő 3’-leszálIó tartományt -, a kapott DNS fragmentum strukturális gén tartományát egy olyan génnel helyettesítjük, amely az értékes anyag termelését kódolja, a helyettesítéssel kapott terméket beiktatjuk egy vektorba, az így keletkezett rekombináns DNS-t - átvitel céljából a BmNPV DNS-sel kombinálva - transzfckció elérésére sejtekbe vagy élő gazdaszervezetbe visszük be és a keletkezett rekombináns BmNPV DNS-t elszaporítjuk. Ugyancsak a találmány tárgyát képezik a következők: - eljárás rckombináns BmNPV DNS előállítására; ezt egy, az értékes anyag termelését kódoló génnel való rekombináció segítségével állítjuk elő (ilyen pl. egy heterológ gén); 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
