202578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csontvelősejtek replikálására három dimenziós sejttenyésztő rendszerben, három dimenziós támasztó anyag a rendszerhez, és eljárás citotoxicitás vizsgálatára ezen rendszer segítségével
11 HU 202 578 B 12 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás csontvelősejtek replikálására, azzal jellemezve, hogy- adott esetben előzetes fibroblasztos kezelés után -(i) egy három dimenziós támasztóanyagot inokulálunk valamely tenyésztő tápközegben humán csontvelő sztrómális sejtekkel; (ii) csontvelő sztrómális sejtek három dimenziós hálózatát összefolyásig növesztjük a három dimenziós támasztóanyagon és adott esetben tartósítjuk; (iii) a csontvelő sztrómális sejtek összefolyó három dimenziós hálózatát humán hematopoietikus nyélsejtekkel inokuláljuk, a nyélsejtek közé beleértve a pluripotenciális, progenitor és/vagy prekurzor nyélsejteket is; és (iv) hematopoietikus csontvelősejt telepeket növesztünk - adott esetben mononukleáris sejtek jelenlétében- a telepek közé beleértve minden olyan hematopoietikus sejttípust, amelyet eredetileg indokuláltunk. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy három dimenziós támasztó anyagként nylonhálót alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan nylonhálót alkalmazunk, amely 400 pm2 szitaterülettel és 100 pm rostátmérővel bír. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan csontvelő sztrómális sejteket alkalmazunk, melyek fibroblasztokat, makrofágokat, retikuláris sejteket és adipocitákat foglalnak magukban. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan tenyésztő tápközeget alkalmazunk, mely magában foglal a máj vagy lép extramedulláris makrofágjainak (Kupffer-sejtek) tenyészközegéből izolált faktorokat (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan hematopoietikus nyélsejteket alkalmazunk, melyek magukban foglalnak eritroid, mieloid, limfoid és makrofág telepeket. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan hematopoietikus nyélsejteket alkalmazunk, melyek magukban foglalnak megakariocitás telepeket is. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a három dimenziós támasztóanyagon lévő sztrómális sejteket fagyasztással tartósítjuk, majd ezt követően a hematopoietikus nyélsejtekkel való inokulálás előtt felengedtetjük. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy perifériás vér mononukleáris sejteket adunk a tenyészetbe négy-öt nappal a hematopoietikus sejtek eredeti inokulálása után, és ezután minden harmadik héten. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mononuklcáris sejtekként zömmel monocitákat alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy ugyanabból az egyénből származó mononukleáris sejteket és hematopoietikus sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hematopoietikus sejteket 33-34 *C hőmérsékleten növesztjük az inokulálástól számított első három napon át, majd ezután 35-37 *C hőmérsékleten növesztjük. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sztrómális sejtek és a hematopoietikus nyélsejtek ugyanabból az egyénből származnak. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 14. A13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hematopoietikus csontvelősejt telepek növekedésének fenntartására a tenyésztő tápközeget helyettesítjük legalább hetenként kétszer az (iv) növesztési lépés során. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sztrómális sejtekként és hematopoietikus sejtekként különböző egyénekből származó sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 16. A15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hematopoietikus csontvelősejt telepek növekedésének fenntartására a tenyésztő tápközeget helyettesítjük hetenként legalább háromszor az (iv) növesztési lépés során. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a három dimenziós támasztóanyagot szolubilizált I-IV típusú kollagénnel burkoljuk be a csontvelő sztrómális sejtekkel a három dimenziós támasztóanyagon való inokulálás előtt. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 18. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fibroblasztos kezelésként (1) a három dimenziós támasztóanyagot olyan fibroblasztokkal inokuláljuk, amelyek kollagént és/vagy más extracelluláris mátrix komponenseket választanak ki; (2) a fibroblasztokat, amelyek kollagént és/vagy más extracelluláris mátrix komponenseket választanak ki, növesztjük a három dimenziós támasztóanyagon; és (3) eltávolítjuk a fibroblasztokat, amelyek kollagént és/vagy más extracelluláris mátrix komponenseket választanak ki, a három dimenziós támasztóanyagról olyan módon, hogy a kiválasztott kollagén és/vagy más extracelluláris mátrix komponensek megmaradjanak, beburkolva a három dimenziós támasztóanyagot vagy beágyazva abba. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 19. A18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (1) lépésben inokulált fibroblasztokként olyan fibroblasztok keverékeit alkalmazzuk, amelyek III, IV, illetve I típusú kollagént választanak ki mintegy 6:3:1 arányban. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fibroblasztokat a (3) lépésben tripszinezésscl távolítjuk el. (Elsőbbsége: 1986.04.18.) 21. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a három dimenziós támasztóanyagot fagyasztással tartósítjuk, miután a fibroblasztokat, amelyek kollagént és/vagy más extracelluláris mátrix komponenst válasz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
