202578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csontvelősejtek replikálására három dimenziós sejttenyésztő rendszerben, három dimenziós támasztó anyag a rendszerhez, és eljárás citotoxicitás vizsgálatára ezen rendszer segítségével
3 HU 202 578 B 4 nizmusba. A három dimenziós támasztóanyag előnyösen háló formájú. Az elkészített támasztóanyagokat lehet tartósítani későbbi felhasználásra egy három dimenziós, fiziológiás sejttenyészet rendszerben. Az egyik kiviteli módban hematopoietikus csontvelősejtek növesztéséhez a hálót úgy készítjük el, hogy sztrómális csontvelősejtek rétegét addig növesztjük a hálón, amíg a sztrómális csontvelősejtek el nem érik az összefolyás állapotát. Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrát. A bejelentésben található egyetlen ábra egy elektronfotomikrográfot mutat be 1,65 ezerszeres nagyításban. Az ábrán látható a (10) hálózat, mely (12) fonalas szálakat és (13) szöveti szálakat tartalmaz, továbbá a (14) sztrómális sejtek láthatók a (12) és (13) szálakon növekedve. Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt. A csontvelő replikálása és fagyasztásos tartósítása csontvelő-átültetéshez való felhasználásra A jelen találmány eljárása szerint kis mennyiséget (10-15 cm3 csontvelő/perifériás vér szuszpenzió) szívunk le egy donor csípőforgójából. Az eljárás eredménye akkor optimális, ha: 1., az egyén 40 évnél fiatalabb, amikor a csontvelejét fagyasztással tartósítjuk; 2., az egyén mentes minden betegségtől. Ez az eljárás előnyösnek bizonyulhat bizonyos betegeknél is, akik áttételes betegségben szenvednek, ha a rosszindulatú sejtek „kiűzését” végre lehet hajtani Fizikai vagy kemoterápiás módszerekkel a tenyésztés előtt. Jelenleg ezek a módszerek akkor a leghatásosabbak, amikor kisszámú sejtet alkalmazunk; ez az a tény, amely jól alkalmazhatóvá teszi ezt az alábbi eljárásban. A csontvelő leszívásának módszere egy donorból jól ismert a szakterületen. Példák és berendezés találhatók a csontvelő leszívásához egy donorból a 4 481 946 és 4 486 188 lajstormszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. A donorból eltávolított csontvelőt azután replikáljuk, vagy tartósítjuk későbbi időpontban való replikáláshoz. Ha a csontvelőt tartósítani akarjuk, a csontvelőt fokozatosan lefagyaszthatjuk, számítógépes programmal ellátott kriotechnológiai berendezést alkalmazva. Friss csontvelő/vér szuszpenzió egyforma térfogatú alikvotjait steril Nunc csövekbe visszük, és zúzott jéggel teli edénybe helyezzük, amíg a krio-tartósító kamrát hasonló hőmérsékletre (4 ”C) be nem állítjuk. Közvetlenül a mintáknak a kamrába való helyezése előtt minden Nunc csőbe egy olyan oldatot adunk steril technikát alkalmazva, hogy a krio-védőanyagok, a dimetil-szulfoxid és a glicerin, végső koncentrációja 7%, illetve 5% legyen. A fagyasztási program azonnal elkezdődik, amint a minta behelyezése megtörtént. A CryoMed Model Number 1010 szabályozó berendezésen az 1. számú fagyasztó programot alkalmazzuk. Ezt a technikát alkalmazva a sejtek életképessége a fagyasztás és 80 'C hőmérsékletű vízben történő gyors felengedtetés után meghaladja a 90%-ot a triptan-kék kizárásos módszer szerint. Ezenkívül az eredeti telepképző egység tenyészet (CFU-C) több mint 80%-át visszanyerjük fagyasztás után. A csontvelő és más biológiai anyagok fagyasztásához alkalmas rendszerekre, amelyek előre kiszámított hőmérséklettel és időgörbével dolgoznak, példák vannak leírva a 4 107 937 és 4 177 881 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban. A csontvelősejteket előnyösen folyékony nitrogén folyadékfázisában tároljuk -196 'C hőmérsékleten, amely hőmérsékleten minden metabolikus sejttevékenység megszűnik. A felengedtetés után a csontvelősejteket infúzióval visszajuttatjuk valamely egyénbe, vagy replikáljuk és azután juttatjuk vissza. A jelen találmány szerinti eljárás számos előnnyel bír az olyan betegek számára, akik csontvelő-átültetésre szorulnak. Ha a beteg saját sejtjeit kapja vissza, ezt hívjuk autológ átültetésnek. Az ilyen átültetésnél kevés a valószínűsége a visszautasításnak. Az autológ átültetés ugyanis megszünteti a csontvelő-átültetés visszautasításának fő okát, az átültetett szövet elleni gazdaszervezet reakciót. Ezentúl, amikor a tenyészetben növesztjük, a hematopoietikus sejtek könnyen elkülöníthetők fizikai manipulációval és/vagy enzimes kezeléssel. Ez megszünteti az érelzáródásos betegség kockázatát, amely a csontvelőembólia eredménye. Ezenkívül a jelen találmány szerinti eljárás lehetővé teszi a neoplasztikus rendellenességek sokkal agresszívebb kezelését kemoterápiás szerekkel és besugárzással. Jelenleg ezeknek a kezeléseknek a kiterjedése gyakran korlátozott a csontvelő toxieitás miatt. Eljárás csontvelősejtek in vitro replikálására A jelen találmány szerinti eljárás tartalmazza a csontvelősejtek replikálásának lépését in vitro, egy olyan rendszerben, amely összeférhető a fiziológiás körülményekkel. Az ebben a rendszerben replikáit csontvelősejtek magukban foglalnak minden olyan sejtet, amelyek jelen vannak a normál csontvelőben, feltéve, hogy minden sejttípus jelen volt az eredeti csontvelő inokulumban. Acsontvelősejteket, akár közvetlenül kapjuk adonorból, akár krio-tartósításos tárolásból élesztjük el, először elkülönítjük retikulumaitól fizikai módszerekkel. A csontvelősejteket azután normál csontvelő sztrómális komponenseivel közös tenyészetben növesztjük, ezek magukban foglalják a fibroblasztokat, makrofágokat, retikuláris sejteket és adipocitákat; a növesztést három dimenziós támasztóanyagon végezzük. Lép és/vagy máj makrofág tenyészetek tápközegéből vagy sztrómális sejtek tenyészetéből származó faktorokat is adhatunk a tenyészethez. Bár a csontvelősejtek képesek korlátozott növekedésre, amikor egyedül tenyésztjük ezeket, ezeknek a tenyészeteknek hosszú időtartamú növekedése csak akkor lehetséges, ha sztrómális sejtek vagy ezek kiválasztott termékei vannak jelen (lásd: „Long-Term Bone Marrow Culture”, szerkesztők: Wright D.G. és Greenberger J.S., kiadó: A.R. Liss, New York (1984). A jelen találmány arra törekszik, hogy maximálissá tegye a multipotenciális hematopoietikus nyélsejtek burjánzását; ezeknek a sejteknek megvan az a képessége, hogy a csontvelőt visszaszaporítsák, amikor a csontvelő belső- vagy környezet által közvetített betegség miatt, vagy valamely betegség kemoterápiával és/vagy besugárzással végzett kezelése miatt elroncsolódott. A nyélscjtekről, amelyek csontvelő visszaszaporítási aktivitással bírnak, kimutatták, hogy fennmaradnak és replikálódnak a hosszú időtartamú csontvelő tenyészetekben. A nyélsejtek, a hemopoietikus előd (progenitor) sejtek, a hematopoietikus prekurzor sejtek azonban mind replikálódnak és burjánzanak a jelen találmány szerinti rendszerben. így pl. az eritroid, mieloid, limfoid, makrofág és megakariocitás telepek képesek folya5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
