202558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neuronotrófiás faktor kinyerésére és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására
HU 202558B tűk a tálankénti GABA- és DNS-felvétel meghatározáskor is. A 7. ábra különösen jellegzetesen mutatja a teljes homogenizátum savas kicsapása és dialízise után nyert marhakivonat különböző hozzáadott koncentrációinak hatását a BZT-érzékeny dopaminfelvételre. A középagyi sejtek oltási sűrűsége 0,5.10° sejt/lcm3 tenyészközeg (24 mm-es tálban). A feltüntetett mennyiségű marhakivqnatot a kikenés időpontjában adagoltuk be 50 mm3térfogatban. Szükség esetén a mintákat marha szérumalbuminnal is kiegészítettük úgy, hogy a végső fehérjekoncentráció 40 p.g/cm3 legyen. A felvételi paramétereket az in vitro tenyésztés negyedik napján értékeltük. A közölt adatok három minta középértékei ± standard deviációval. Mindezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy az aktív anyag növelni tudja különböző típusú neuronok in vitro túlélését és fejlődését, azokét mindenesetre, amelyek a használt tenyészetekben jelen voltak. Noha hasonló hatásokat akkor is kimutattunk, amikor a felülúszó kivonatok, a SephadexG-150 oszlopról eluálódó, 10 és 30 kilodalton között gyűjtött frakciók és a TSK-CM-3SW oszlopról mól/1 ammónium-acetátnál eluálódó frakció-csoport trófiás aktivitását vizsgáltuk, de az ehhez a hatáshoz szükséges anyagmennyiség különböző volt. Konkrétan: míg a nyers felülúszó kivonat mintegy 6 p.g/cm3 koncentrációban mutatta a maximális biológiai hatás félértékét in vitro, a Sephadex G-150 ill. a TSK-CM-3SW oszlopokról nyert frakciókkal up'anezt a félértéket 0,3 p.g/cnr ill. 10 ng/cm3 szinten lehetett elérni (lásd 1. táblázat). Más típusú idegsejtek, elsősorban egér fötális striatumából származó, disszociált idegsejtek biológiai aktivitásának in vitro vizsgálata azt mutatta, hogy az aktív molekula hatásosan növeli az idegrendszer, különösképpen a központi idegrendszer különböző területein jelenlevő, különféle típusú neuronok túlélését és fejlődését. Sőt az aktív anyag hatásosan növelte 12-napos csirkeembriók dorzális gyökér ganglion neuron jainak in vitro neurit-növekedését, de a 8-napos embrióét nem. Ez az effektus is azt mutatta, hogy ez a neuronotrófiás faktor különbözik az egér nyálmirigyekből nyert béta-NGF- től.- Az egér nyálmirigyekből származó béta-NGF különböző koncentrációinak (1 ng/cm-től 300ng/cm-ig) hozzáadása valóban nem befolyásolta a tenyészetben a szokásosan használt, egérből származó, dosszociált, középagyi sejtek túlélését. A találmány másik tárgya az emlős agyvelőből származó neuronotrófiás faktor (SDNF) in vivo alkalmazása, vagyis ezt a faktort tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása. Amint az előzőekben tárgyaltuk, ismeretes, hogy a neuronotrófiás faktorok nemcsak az idegrendszer fejlődése során szabályozzák az idegsejtek túlélését és a neuronok alkalmazkodóképességét (amelyet az idegsejt azon képességével definiálnak, morfológiai-funkcionális módosulást szenved a mikrokörnyezet megváltozásának hatására), hanem feltehetőleg felnőtt állapotban is. Valóban gyűlnek a bizonyítékok, amelyek arra utalnak, hogy a neuronotrófiás faktorok alighanem szabályozzák a felnőtt neuronokat is a következő funkciókban: 13 I. A normális sejtek fennmaradásában, funkcionális teljesítőképességében és öregedésében (S. Varon: Discussions in Neuroscience, Vol. n, No. 3, 1985), vagyis a neuronotrófiás faktoroknak kellő mennyiségben kell rendelkezésre állniok és használhatóknak lenniük a trófiás szükségletek normális kielégítésére, következésképpen a felnőtt neuronok rendellenes in vivo működése a trófiás anyag nem kielégítő előfordulását tükrözheti. II. A kémiaüag vagy mechanikusan károsodott sejtek megjavulásában és regenerálódási folyamataiban (s. Varon: ugyanott), különösen az idegnyúlvány-károsodások vezetnek az idegsejtek hiányos neuronotrófiás faktor-ellátásához, és ismeretes az idegsejtek pusztulása sérülése vagy kóros károsodások következtében, de lehetségesek az öregedési folyamatok során is. ül. Elfajulásban és elpusztulásban bizonyos patológiás körülmények között (S. Varon: ugyanott), vagyis különböző kóros esetek kapcsolatban lehetnek károsodási helyzetekkel, és okozói vagy következményei lehetnek olyan trófiás hiányoknak, amelyek vagy egy hatásos trófiás anyag csökkent mennyiségéből, vagy a trófiás szükséglet megnövekedéséből, esetleg mindkettőből adódnak. A fentiek figyelembe vételével a találmány az SDNF-nek nevezett neuronotrófiás faktor alábbi alkalmazásaira is vonatkozik, nevezetesen az SDNF molekula parenterális alkalmazására (beleértve, de nem kizárólag peridurális, intracisztemális, intraventrikuláris, intratekális, intravénás, intramuszkuláris, szubkután, gingivális, szublingvális, rektális és nazális bevitelt) akár önmagában, akár gangliozidokkal egybekapcsolva (különösen marha agyvelő gangliozidjainak keverékeivel, marha agyvelőből származó egyedi gangliozid fajtákkal, célszeren GMi-gyel, félig szintetikus gangliozid-származékokkal, célszerűen gangliozid belső észterek szrámazékaival) vagy foszfolipidekkel együtt (különösen marha agyvelő foszfolipidjeinek keverékeivel, egyedi marha agyvelő foszfolipidekkel, célszerűen foszfatidil-szerinnel és félig szintetikus foszfolipid származékokkal) az alábbi eredetű neuropatológiás körülmények között: I. Az idegrendszer heveny, félheveny vagy krónikus károsodása, beleértve a sérüléses károsodást, a kémiai károsodásokat, a vazális károsodásokat vagy hiányokat (pl. hűdés), a fertőzéses/gyulladásos és daganat-keltette károsodásokat is. II. Az idegrendszer elöregedése, ideértve az Alzheimer-kórt is. ül. Az idegrendszer krónikus ideg-elfajulásos betegségei. IV. Idegrendszeri vagy az idegrendszert befolyásoló, krónikus immunológiai betegségek. Az SDNF molekula felhasználásának kapcsolódását a gangiliozidokkal és a foszfolipidekkel bizonyítékok támasztják alá. Ezek arra mutatnak, hogy mint ismeretes, a marha agyvelő gangliozidjai és foszfolipidjei erősítik a neuronotrófiás faktorok sejteken jelentkező hatását in vitro és nagy valószínűséggel ín vívó is. A 2. táblázat a GMi és a szarvasmarha striatum kivonatának hatását ismerteti a középagyi sejtek tenyészetére. 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
