202471. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amino-pimelinsav-származékok és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202471B 2 laposfenekű mikrolemezen osztottuk el, 5% borjúszérum, glutamin, Hepes-puffer és antibiotikummal dúsított RPMI1640 közegben. 24 óra után a próba alatt álló felüluszók különböző hígításainak 100 pl-eit adtuk hozzá, valamint aktinomicin-D-t 1 pg/ml dózisban. 24 óra tenyésztés után a fel nem oldódott sejtek mennyiségét a lemezek kristályibolyával történő színezésével és a különböző lyukak optikai denzitásának multiscan-olvasón való mérésével értékeltük. Eredmények: A 9. példa terméke serkenti a monocitákat és az IL- 1 és TNF termelésüket. Továbbá szinergizmus van a termékek és a gamma-interferon között. B) Antibakteriális aktivitás (in vitro) A termékektől elvárt antibakteriális aktivitást Davis Mingoli-közeghez adott 1% agaron történő diffúziós módszerrel határoztuk meg. Az agarokat 48 °C- on Petri-csészékbe öntöttük, miután a vizsgálandó baktérium-törzs 5 x 10~5 csíra/ml-ével beoltottuk. Ezek az oltványok egy 24 órával korábban Davis Mingoli folyékony táptalajon történt tenyésztésből származnak. Az agarok megszüárdulása után a tanulmányozandó termékek vizes oldatát egy lyukasztóval a lyukakba fúrtuk. 24 órás, 37 °C-on történő inkubálás után a megfigyelhető inhibíciós zónát (átmérő mmben) mértük. 6. példa 13. példa terméke terméke (25 ml/1) (25 mg/1) Escherichia coli 078 17,5 Salmonella typhimurium MZ11 24 20 Enterobacter cloacae 1321E Providencia sp. DU48 10 22 C) Antibakteriális aktivitás (in vivo) 18-20 grammos (Charles River Cobs nem beltenyésztett CDI) svájci nőstény egereket használtunk ehhez a kísérlethez. Minden csoport 20 állatból állt. A különböző termékeket csíramentes élettani szérumban oldottuk úgy, hogy 1-10-100 mcg/egér vagy 50-500-5000 mcg/kg koncentrációt nyerjünk A fertőző szuszpenzió készítése (IP 52 145 törzs) a. A törzs konzerválása és gondozása A liofilizált törzset néhány csepp szója „trypcase” (BioMerieux) folyékony táptalajjal rehidráltuk. 10 ml szója „trypcase” táptalajt tartalmazó csövet a nyert szuszpenzióval oltottunk be és 37 °C-on inkubátorban tenyésztettünk 18 órán át. Konzerváló agar (Pasteur) csövet középponti szúrás során e tenyészettel oltottunk be. 18 órás 37 °C-os inkubátorban való tenyésztés után a csöveket 22 °C-on tartottuk b) Tenyésztés Szója „trypcase” táptalajt tartalmazó csövet konzerváló agarral oltottunk be és 18 óra hosszatt 37 °C- on inkubátorban tenyésztettünk A ferde szója „trypcase” agart e tenyészetből oltottuk be. 18 órás 37 °C-on történt inkubálás után a csírákat kinyertük az agar felületén és élettani szérumban szuszpendáltunk egy platina-kacsnyit 10 ml élettani vízként. A csírakoncentrációt Coulter Counter-es számlálással értékeltük A baktérium-szuszpenziót a kívánt csíraadag eléréséig hígítottuk, majd 0,2 ml/egér adagban intravénásán befecskendeztük Az újraéleszthető csírák mennyiségét „trypcase” agart tartalmazó Petri-edényekben történő szélesztéssel ellenőriztük Az eredmények értékelése A kezelést 24 órával a fertőzés előtt 0,05 ml/egér mennyiségű intramuszkuláris injekcióval végeztük A csírákat 0,2 ml/egér mennyiségben intravénásán fecskendeztük be. Az állatokat 21 napig megfigyeltük Összehasonlítottuk a nem kezelt (kontroll) állatok és a különböző termékekkel kezelt állatok mortalitását. Az eredményeket a túléléssel fejeztük ki (minden csoportban a 21 napos megfigyelés végén a túlélő állatok száma). A kezelt és a kontroll csoport túlélésének összehasonlításához a Fisher-tesztet használtuk Ahol a túlélésben egyértelmű növekedést nem lehetett kimutatni, ott minden csoportnál átlagos túlélési időt (ÁH) számoltunk Ebben az esetben a Mann és Whitney-teszttel végeztünk statisztikai analízist, összehasonlítva a kezelt és a kontroll csoportokat. A tanulmányt IBM PC számítógépen, Tadpole-programmal végeztük Különösen szignifikáns védelmet figyeltünk meg a 8. példa termékével 5 mg/kg adagban kezelt csoportnál: az eredményeket ÁTI-ben vagy a 21 napos megfigyelés végén való túléléssel fejeztük ki D) Aktivitás humán monocitákon Az 5. és 9. példa termékei direkt hatást mutattak humán monocitákon, amely hatást a TNF-aktivitás és EL-1 aktivitás termelődésén mértük a tenyészet-felülúszóban (5 g termékkel). Továbbá CHU-EFN-g jelenlétében a 9. példa esetében olyan hatás kimutatása volt lehetséges, amely legalábbis serkenti a monokinek (TNF és EL-1) termelését. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás (I) általános képletű amino-pimelinsavszármazékok és szervetlen vagy szerves savakkal vagy bázisokkal alkotott addíciós sóik és 1-6 szénatomos alkil-észtereik előállítására, az (I) képletben U jelentése (1) általános képletű csoport, ahol a szaggatott vonalak azt jelentik, hogy a csoport tartalmazhat egy cisz vagy transz konfigurációjú kettős kötést és a jelentése hidrogénatom vagy metüéncsoport, Y jelentése hidrogénatom vagy egy a- vagy omega helyzetű karboxilcsoporttal kapcsolódó aminosavcsoport az alábbiak közül: Gly, Alá, Val, Be, Leu, Asp, Glu, Lys, vagy Ala-Glu dipeptid, ahol az aminocsoport adott esetben 2-20 szénatomos alkanoilcsoporttal vagy egy 2-5 szénatomos a, (o-dikarbonsavból képzett alkanoilcsoporttal adlezve lehet, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16
