202323. lajstromszámú szabadalom • Eljárás prosztaglandin E2 tartalom radioimmunológiai meghatározására
3 HU 202 323 B 4 tracer-kiszorításhoz tartozó dózis, az ún. ID» érték is közel tízszeresére nö az azonos egyensúlyi állandóknál számított IDjo értékhez képest A'“I-PGE^TME radioligandumon alapuló egyensúlyi RIA-kkal kapcsolatos saját kísérleti tapasztalataink is azt támasztják alá, hogy a homológ assay-vel lényegében megegyező érzékenység az általános, míg a korábban említett, minden tekintetben hiteles forrás által elért elméleti érzékenység egyedi kivételnek tekinthető. Ezzel magyarázható, hogy különböző PGEj-antigénekkel szemben az elmúlt évek során nyulakbó! nyert tizenhétféle PGE2-antitesttel egyetlen esetben sem tapasztaltunk érzékenységnövekedést a homológ assay-hez képest. Számadatokkal alátámasztva; az említett különböző antiszérumok esetében egyensúlyi RIA-ban az ID50 érték 100-150 Ci/mmól moláris aktivitású 3H-PGErtracerrel 25-50 pg/cső, míg az 1500- 2000 Ci/mmól moláris aktivitásúra becsülhető 125I-PGEj-TME tracerrel 12-200 pg/cső között változott. Felismertük tehát, hogy olyan antigén-antitest reakción alapuló radioimmun meghatározás dolgozható ki, mely az ismert eljárásoktól abban különbözik, hogy egyensúlyi módszer helyett szakaszos, szekvenciális telítést alkalmaz, melyben az inakü'v ligandumnak és a tracemek antitesthez való kötése két lépésben történik; első lépésben az inaktív ligandumot az antitesttel az egyensúly eléréséig reagáltatjuk, majd a második lépésben, a tracer hozzáadása után az új egyensúly kialakulásához szükséges időnél rövidebb reakcióidőt alkalmazunk. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás biológiai minta (szövet, vér, vizelet stb.) prosztaglandin Ez (továbbiakban PGEj) tartalmának antigén-antitest reakciós meghatározására ismert mennyiségű, hígítási sorozat szerint különböző PGEj koncentrációjú standard oldatok, specifikus antitest és nagy fajlagos aktivitású jód- 125-izotóppal jelzett prosztaglandin Ermonojód-tirozin-metilészter (továbbiakban 12SI-PGE2-TME) mint nyomjelző anyag (továbbiakban tracer) felhasználásával, melynek során megmétjük a tracemek specifikus antitesttel való kötődését az ismert mennyiségű, pufferoldattal készített hígítási sorozat szerint különböző koncentrációjú PGE2 standard oldatok és a meghatározandó minták jelenlétében, majd a standard koncentrációkhoz tartozó kötésváltozások ismeretében a mintákhoz tartozó kötésváltozások alapján számítjuk a mindenkori közegminta hatóanyagtartalmát, olyan módon, hogy a specifikus antitestet első lépésben a PGE2 hígítási sorozattal és a mindenkori közegmintával reagáltatjuk, előnyösen a kötési egyensúly eléréséig, az így kapott reakcióelegyhez hozzáadjuk a tracert, majd az elegyet az egyensúly eléréséhez szükséges időnél rövidebb ideig reagáltatjuk. A találmány szerinti eljárásban hígítási sorozat szerint különböző, ismert mennyiségű inaktív PGE2 standard oldatokat, valamint az ismeretlen mintákat specifikus antitesttel inkubáljuk, majd az elegyhez 125I-PGE2- -TME tracert adunk, megfelelő inkubálási idő után az antitesthez kötött, illetve nemkötött frakciókat elválasztjuk, és mérjük a kötött frakció radioaktivitását. A kapott radioaktivitás értékekből az ismeretlen minták által okozott kötésváltozásokhoz tartozó PGE2-koncentrációkat kiszámítjuk. Általában 10 000 és 60 000, előnyösen 20 000 és 40 000 cpm közötti beütésszámú tracert alkalmazunk, amelyet oldószerben, célszerűen puffer-oldatban oldunk. Puffer-oldatként előnyösen 0,1% zselatint tartalmazó, 0,01-0,2 mólos, célszerűen 0,05 mólos, 7,4 pH-jú vizes foszfát puffer-oldatot használunk. Az oldat konkrét összetételétől függően az inkubációs hőmérséklet mind az inaktív ligandummal, mind a tracerrel 0 és 10 ‘C közötti, az inaktív ligandummal való inkubálás ideje az adott hőmérséklettől függően 10 és 40 óra közötti, előnyösen 18-24 óra, míg a tracerrel való inkubálás ideje a hőmérséklettől és az antitest koncentrációjától függően 0,5-4 óra, előnyösen 1-2 óra között változtatható. Tapasztalati tény, hogy a szekvenciális telítési analíziseknél kapott kísérleti hiba nagyobb, mint az egyensúlyi RIA-ban, vagyis a mérés reprodukálhatósága általában romlik. Ennek oka az, hogy a tracerrel való inkubálás kísérleti körülményeinek állandóságát nehéz biztosítani, elsősorban a rövid inkubációs idő miatt. A találmány szerinti eljárás lényeges előnye az, hogy az inkubációs idő kellően hosszú ahhoz, hogy pontosan betartható legyen, így a mérés statisztikus hibája nem emelkedik számottevően. így például a tracer specifikus kötése, az ún. BO/T érték 17 egyensúlyi RIA-ban 44,8%, a korrigált szórás 4,85, a relatív szórás 10,8% voÍl A megfelelő értékek a találmány szerinti eljárással mért 16 kalibrációs görbe adataiból 38,9%, 6,13%, illetve 15,76% volt, tehát a statisztikus hiba növekedése az immunoassay-ben elfogadható értéket nem haladja meg. A specifikus antitest célszerűen nyúlból nyert anti- PGE2 antiplazma, amelynek koncentrációját úgy választjuk meg, hogy az adott elválasztó reagens és inkubációs idő alkalmazása mellett az inaktív PGE2-t nem tartalmazó mintában a tracer 20-50, előnyösen kb. 40%-a kötődjön az antitesthez. A találmány szerinti eljárás lényeges előnye, hogy az antitest koncentrációját az egyensúlyi módszerhez képest csak viszonylag kis mértékben kell növelni (az eljárás szerinti konkrét példában mintegy kétszeresre), és ez nem befolyásolja a mérés gazdaságosságát. Ugyanakkor az érzékenység növekedése számottevő; az előbbi méréssorozatokban - gyakorlatilag azonos BO/T értékek mellett - a találmány szerinti eljárással kapott ID» érték 4,66 pg, a szórás 1,16 pg, míg az egyensúlyi módszerrel 15,87 pg, a szórás4,995. Ennek megfelelően csökken a kimutatási határ is; előbbi esetben 0,463 pg (a szórás 0,19), utóbbinál 1,055 pg (a szórás 0,554). Az érzékenység növekedése tehát a találmány szerinti eljárással az összehasonlításra inkább alkalmas ID» értékek alapján több mint háromszoros. A radioligand kötött és szabad frakcióinak elválasztására előnyösen 0,5% dextránt és 1% csontszenet tartalmazó 0,01 mólos foszfát-puffer-oldatot (pH 7,4) alkalmazunk, amely a szabad radioligandumot megköti. Az ebből centrifugálással kapott felülúszó tartalmazza az antitesthez kötött tracert, amelynek radioaktivitását szcintillációs módszerrel mérjük. Ismert elméleti és tapasztalati tény, hogy az egyensúlyi RIA-ban egyébként azonos kísérleti körülmények mellett az érzékenység csak azáltal javítható, hogy csökkentjük a BO/T értéket. Ezzel azonban csökken a mért radioaktivitás értéke is, a kisebb radioaktivitás pedig csak nagyobb statisztikus hibával mérhető, így az egész meghatározás statisztikai paraméterei is romlanak. Ez5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
