202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
13 HU 202288 B 14 sítjuk, majd a (Vili) általános képletű vegyülettel, vagy a (X) vagy (XI) általános képletű vegyülettel, amelyben előzőleg az R3 védöcsoportot bázissal lehasitottuk (a 2-ciano-etil-csöpört jelentésű R3-at például tri(rövidszénláncú alkil)-aminnal, például trietilaminnal, a fenti inert oldószerek vagy oldÓ6zerelegyek egyikében 10-40 °C-on, különösen szobahőmérsékleten), adott esetben vizelvonószer vagy bázis jelenlétében reagáltatjuk. Az ily módon előállított (XIII) általános képletű vegyülettel - a képletben R1, RJ és B jelentése a fenti és n jelentése az 1-4 egész szám - annyiszor ismételjük meg a (VI) általános képletű vegyületre leirt reakciólépéseket [R1 lehasitása, a (VIII), (VIIIA), (X), (XI) általános képletű vegyületekkel vagy a megfelelő tetranukleotiddal való reagáltatás, adott eseten ezt követő oxidativ kezeléssel], amíg (XIII) általános képletű vegyület képződik, amelyben n jelentése kb. 19 és 69 közötti tetszés szerint választott egész szám. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában R1 védócsoportként 4-metoxi-tritil-csoportot alkalmazunk és a cink-bromidos hasítást CH- vagy NH-sav jellegű vegyület, különösen 1,2,4-triazol vagy tetrazol jelenlétében végezzük. Például az 1,2,4-triazol alkalmazása a 4-metoxi-tritil-védöcsoport lehasítására új, és meglepő módon gyors, nagyhozamú és mellékreakciók nélküli hasítást eredményez. Különösen előnyös a cink-bromid és az 1,2,4-triazol 20:1 é6 100:1 közötti mólarányban való alkalmazása aprotonos oldószerből és alkoholból, például metilén-kloridból és 2-propanolból álló oldószerelegyben. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában valamely (VI) vagy (XIII) általános képletű vegyületet, amelyben az R1 védőcsoportot lehasitottuk, (XI) általános képletű trinukleotiddal - amelyben az R3 védőcsoportot lehasítottuk - reagáltatjuk vízelvonószer, például 2,4,6-trimetil- vagy triizopropil-benzolszulfonil-klorid, -imidazol, -tetrazol vagy -1,2,4-triazol, amelyek adott esetben nitrocsoporttal szubsztituáltak, jelenlétében. Különösen előnyös a (XII) képletű l-(2,4,6-trimetil-benzolszulfonil)-3-nitro-l,2,4-triazol. Az a különösen előnyös kombináció, amely szerint R1 védócsoportként 4-metoxi-tritil-csoportot alkalmazunk, R*-et 1,2,4-triazol jelenlétében cink-bromiddal hasítjuk le és a (XIII) általános képletű nem védett oligonukleotid-polisztirolgyanta (XI) általános képletű nem védett trinukleotiddal való reakciójához (XII) képletű triazolt alkalmazunk vizelvonószerként lehetővé teszi, hogy meglepő módon kb. 40-70 bázishosszúságú nukleotidláncokat is rövid idő alatt, nagy kitermeléssel és nagy tisztaságban állítsunk elő. Az oligodezoxinukleotidoknak a hordozóról való találmány szerinti lehasításához és a védócsoportok d) reakciólépés szerinti eltávolításához önmagában ismert eljárásokat alkalmazunk. A hordozóról történő lehasitáshoz és az előnyös 2-klór-fenil-védöcsoport eltávolításához különösen előnyösen alkalmazható reagens valamilyen aril-aldoximát, például az l,l,3,3-tetrametil-guanidinium-2-nitrobenzaldoximát. A reakciót a fenti inert oldószerek egyikében, amelyhez előzőleg kevés vizet adunk, például 95%-os piridinben, szobahőmérsékleten végezzük. Utána vizes ammóniával reagáltatjuk szobahőmérsékleten, például 20-70 °C-on, előnyösen 50 °C-on. A találmány szerinti oligodezoxinukleotidok összekapcsolásához az 5'-végen levő hidroxicsoportra foszfátcsoportot viszünk. A foszfátcsoport bevitele (foszforilálás) önmagában ismert módon T4 polinukleotid-kináz segítségével ATP jelenlétében történik. A kódoló és a komplementer szál találmány szerint előállított oligodezoxinukleotidjait átfedő szekvenciákat tartalmaznak, amelyek legkevesebb 3, előnyösen 8-15 átfedő bázispárból állnak. Ha ilyen oligodezoxinukleotidokat összekeverünk, a köztük kialakuló hidrogénhidak összetartják őket. Az elálló, egyes szálú végek az el) é6 e2) reakciólépésnek megfelelően mátrixként (templátként) szolgálnak a második (komplementer) szál felépítéséhez, amit DNS-polimeráz, például DNS-polimeráz I, a DNS-polimeráz I Klenow-fragmense vagy T4 DNS-polimeráz vagy AMV reverz transzkriptáz végez a négy dezoxinukleotid-trifoszfát (dATP, dCTP, dGTP és dTTP) jelenlétében. A kiegészítésnél képződő DNS-duplexek, amelyek alatt különösen a deszulfatohirudin-gén fragmensei (el eljáráslépés) vagy a teljes deszulfatohirudin-gón (e2 eljáráslépés) értendő, tompa végűek. A deszulfatohirudin-gén el) eljáráslépéssel kapott fragmense a végeken olyan nukleotidszekvenciákat tartalmaznak, amelyeket a restrikciós endonukleázok képesek felismerni és elhasítani. A nukleotidszekvenciák é6 ennek megfelelően a restrikciós endonukleázok megválasztásától függően a hasításnál teljesen bázispárosodott (tompa) végek (.blunt ends’) vagy elálló DNS-szálat tartalmazó végek (.staggered ends’) képződnek. A restrikciós felismerési szekvenciákat úgy választjuk meg, hogy a tompa végeket képző restrikciós endonukleázokkal kezelt DNS-fragmentek összekapcsolása, illetve a kohéziv végek bázispárosodása és az elálló DNS-szálakat tartalmazó DNS-fragmensek ezt követő összekapcsolása teljes deszulfatohirudin struktúrgént eredményezzen. Két kettős szálú DNS-fragmens összekapcsolása a donor-fragmens 5’-végén foszfátcsoportot, az akceptorfragment 3’-végén szabad hidroxicsoportot igényel. Az el) lépésben keletkező DNS-fragmensek az 5’-végen már foszforiláltak és ezeket önmagában ismert módon ligázzal, különösen T4 DNS-ligázzal kapcsoljuk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
