202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
47 HU 202288 B 48 145-DNS-sel (lásd fent) kapcsoljuk 20 pl reakciótérfogatban, amely 0,5 mM íATP-t (Sigma), 10 mM DTT-t (Calbiochem), 20 mM Tris.HCl-t (pH = 7,8), 1 mM MgClz-t és 800 egység T< DNS-ligázt (Biolabs) tartalmaz. 15 °C-on 2 órán ét inkubáljuk. A ligázt 85 °C-on 10 perces inkubálással inaktiváljuk. Utána 2 térfogat vizet adunk hozzá, a konyhasó koncentrációt 10 mM-ra állítjuk és 20 egység kPNI-et (Biolabs) adunk hozzá 30 perc alatt 37 °C-on. Fenolos és kloroformos extrakció után az elegyet 0,9%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen (Biorad) 40 mM Tris.acetát (pH = 7,8), 1 mM EDTA és 0,5 Mg/ml etidium-bromid összetételű pufferben frakcionáljuk. Az UV-sugárzásban látható, hogy azonos nagyságú marker-DNS-sel megegyező mozgékonyságú sávokat szikével kivágjuk. A géldarabot 65 °C-on 5 perc alat megolvasztjuk, majd 37 °C-ra hűtjük. Kb. 20 pl térfogatú oldatot kapunk. Az oldatból 5 pl-t kiveszünk és 400 egység Ti-ligázzal (Biolabs) inkubáljuk 12 órán át 15 °C-on 10 pl reakciótérfogatban, amely 0,5 mM ATP-t, 10 mM DTT-t, 10 mM MgCh-t, 20 mM Tris.HCl-t (pH = 7,8) tartalmaz. 1/10 térfogat 100 mM Tris.HCl-t (pH = 7,5), 100 mM CaCk-t és 100 mM MgClz-t tartalmazó oldatot adunk a ligáz-elegyhez (15 °C-on megszilárdul) és 65 °C-on 5 percig inkubáljuk. Utána az oldatot a fenti módon kalciummal kezelt E.coli HBlOl-sejtek transzformációjához alkalmazzuk. 50 Mg/ml ampicillinnel kiegészített McConkey-agarleraezekre visszük. 10 különböző kolónia plazmid-DNS-ét a fenti módon izoláljuk, éB a DNS-t a következő restrikciós enzimekkel analizáljuk: 0,5- -0,5 jug plazmid-DNS-t egymásután Kpnl-gyel (Biolabs) és EcoRI-gyel (Biolabs) hasítunk az enzimgyártó előiratai szerint. A hasítási terméket 1% agarózgélen 40 mM Tris.acetát (pH = 7,8), 1 mM EDTA, 0,5 Mg/ml etidium-bromid összetételű oldatban frakcionáljuk. A kívánt módon mindegyik plazmid egy-egy, a fenti enzimekhez tartozó hasítási helyet mutat. Az egyik plazmidot HRÍ148 jelöléssel látjuk el. A HRÍ148 plazmid triptofán-promoter-operátort ATG-ig és vele egy riboszómális kötőhelyet tartalmaz. A hirudin gént akárcsak más heterológ géneket közvetlenül a plazmidban egyszer előforduló EcoRI, Ncol, Kpnl-helyekre kapcsolhatjuk. Ez a szerkesztés lehetővé teszi a heterológ gének közvetlen össze kapcsolását és kifejeződését anélkül, hogy az iniciációhoz és a transzlációhoz szükséges ATG jelenléte a megfelelő génen szükséges lenne. Ezt Ncol-gyel való hasítással és az elálló végek DNS-polimeráz I-gyel való feltöltésével a leirt módon, vagy Kpnl-gyel történő hasítással és az elálló végek Sí nukleázzal való eltávolításával könnyen elérhetjük. A HRÍ148 plazmid igy egy széles körben alkalmazható expressziós plazmid. D. A linearizált pHRil48/EcoRI/BamHI vektor előállítása 5 Mg pHRil48 plazmid-DNS-t EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázzal megemésztünk. A kimetszett pHRil48/EcoRI/BamHI vektort sűrűséggradiens centrifugálással izoláljuk. b) Az Fi-DNS/EcoRI/EcoRII és az Fi-DNS/BamHI/EcoRII előállítása I. Az Fi-DNS/EcoRI/EcoRII előállítása 5 Mg pML 300 plazmid DNS-t először 10 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal megemésztünk 50 m1 100 mM Tris.HCl (pH = = 7,5), 50 mM NaCl és 100 Mg/ml zselatin öszszetételű oldatban 1 órán át 37 °C-on. A linearizált DNS/EcoRI plazmid alikvotját (0,5 Mg) agarózgélból gélelúcióval izoláljuk (vö. 10a. példa) és (v^P/ATP-vel radioaktiven jelezzük) (vö. 12. példa). A DNS/EcoRI plazmid főtömegét ezután a radioaktiv jelzett DNS-sel összekeverjük, EcoRII restrikciós endonukleázzal megemésztjük és az EcoRI*DNS-fragmentet (109 bázispár) 8%-os poliakrilamidon gélelektroforézissel elválasztjuk. 200 Mg Fi-DNS/EcoRIVEcoRII-t gélelúcióval izolálunk. II. Az Pz-DNS/BamHI/EcoRII előállítása 5 Mg pML305 plazmid DNS-t 10 egység BamHI restrikciós endonukleázzal hasítunk. Ennek a linearizált DNS/BamHI plazmidnak egy alikvotját (0,5 Mg) agarózgélból gélelúcióval izoláljuk (vő. 10a. példa) és (t32?)-tal radioaktívan jelezzük (vö. 12. példa). A DNS/BamHI plazmid fótömegét ezzel a radioaktív jelzett DNS-sel összekeverjük, EcoRII restrikciós endonukleázzal megemésztjük és az EcoRII-BamHUDNS-fragmentet (122 bázispár) 8X-06 poliakrilamidon gélelektroforézissel elválasztjuk. 250 Mg Fz-DNS/BamHlVEco- RlI-t izolálunk. c) Az Fi-DNS összekapcsolása az Fi-DNS-sel és a pML310 expressziós plazmid megszerkesztése 10 ng (= 473 nmól végek) Fi-DNS/Eco- RI/EcoRII-t és 9 ng (= 495 nmól végek) Fz-DNS/BamHI/EcoRIJ-t 20 m1 térfogatban T«-DNS ligázzal kezelünk és a 10c) példában már leirt módon. Utána az elegyet fenol/kloroformmal extrahóijuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A DNS-csapadékot utána a 10c) példában leirt módon oldjuk és EcoRI- és BamHI-restrikciós endonukleázzal megemésztjük. Az oldatot ezután TNE-re állítjuk és 30 ng (= 50 nmól végek) pHR148/EcoRI/BamHI vektor-DNS-t (vö. 13aD példa) adunk hozzá. Utána az oldatot ismét fenol/kloroform elegygyel extraháljuk és a DNS-t alkohollal ki5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 26
