202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
21 HU 202288 B 22 acetát, amely vagy egymagában vagy keverékben alkalmazható. Alkalmas nitrogénforrások például az aminosavak, Így a kozaminosav, peptidek és fehérjék és lebomlási termékeik, például a tripton, pepton vagy húskivonatok; továbbá az élesztókivonatok, malátakivonat, és ammóniumsók is, például ammónium-klorid, -szulfát vagy -nitrát, amelyeket egyedül vagy alkalmas keverékekben alkalmazhatunk. Hasonlóképpen szervetlen sókat is alkalmazhatunk, például a nátrium-, kálium-, magnézium- és kalcium-szulfátot, -kloridot, -foszfátot és -karbonátot. Ezenkívül a közeg például növekedést elősegítő anyagokat tartalmaz, így nyomelemeket, például vasat, cinket, mangánt és hasonlókat, és előnyösen olyan anyagokat, amelyek szelekciós nyomást fejtenek ki és gátolják azoknak a sejteknek a növekedését, amelyek az expressziós plazmidot elvesztették, így a közeghez például ampicillint adagolnak, ha az expressziós plazmid ampB-gént tartalmaz. Ha ilyen antibiotikus hatású anyagokat adunk a közeghez, akkor a szennyező, antibiotikum-érzékeny mikroorganizmusok elpusztulnak. A tenyésztés önmagában ismert eljárásokkal történik. A tenyésztés feltételeit, például a hőmérsékletet, a közeg pH értékét és a fermentációs időt úgy választjuk meg, hogy maximális hirudin-titert kapjunk. így előnyös valamely E.coli- vagy élesztőtörzset aerob körülmények között szubmersz kultúrában rázás vagy keverés közben 20-40 °C hőmérsékleten, előnyösen 30 °C-on, és pH 4- -9-en, előnyösen pH 7-en, 4-20 órán át, előnyösen 8-12 órán át tenyészteni. Az expreszsziós termék intracellulárisan gyűlik össze. Ha a sejtsűrűség megfelelő értéket ér el, a tenyésztést megszakítjuk és a mikroorganizmus sejtjeiből a terméket szabaddá tesszük. Ebből a célból a sejteket például detergenses, így SDS-es vagy Triton-os kezeléssel elroncsoljuk, vagy lizozimmal vagy hasonló hatású enzimmel oldjuk. Alternativ vagy kiegészítő módon mechanikus erőt, például nyiróerőt (például X-prés, French-prés, Dyno-malom), vagy üveggyönggyel vagy aluminium-oxiddal való rázást, vagy váltakozó lefagyasztást, például folyékony nitrogénben, és felengedést, például 30-40 °C-ra, valamint ultrahangot alkalmazhatunk a sejtek feltárásához. A kapott elegyet, amely fehérjéket, nukleinsavakat és egyéb sejtalkotókat tartalmaz, centrifugálás után önmagában ismert módon fehérjére nézve töményitjük. így például a nem-fehérjealkotók legnagyobb részét polietilénimines kezeléssel leválasztjuk és a fehérjéket, beleértve a hidrudinvegyületeket, például az oldat ammónium-szulfátoa vagy más sóval történő telítésével kicsapjuk. A bakteriális fehérjék ecetsavas savanyítással (például 0,1%, pH = 4-5) is kicsaphatók. A hirudinvegyületek további töményitéBe az ecetsavas maradék n-butanolos extrakciójával érhető el. További tisztítási lépés például valamilyen kromatográfiás eljárás, Így az ioncserélő kromatográfia, gélkromatográfia, megoszlási kromtográfia, nagynyomású folyadékkromatográfia, fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia és hasonlók. Az elegy komponenseit diaUzissel, töltés szerint gél- vagy hordozómentes elektroforézissel, molekulanagyság szerint alkalmas Sephadex oszlopon, affinitás-kromatográfiával, például affinitás-kromatográfiára alkalmas hordozóra kapcsolt antitestekkel, különösen monoklonális antitestekkel, vagy trombinnal, vagy további, különösen az irodalomból ismert eljárással választjuk el. Például a kifejeződött hirudin izolálása a következő lépésekből áll: A sejtek elválasztása a tápoldatból ce n trif u gálá s sál; Nyerskivonat előállítása a sejtek elroncsolásával, például lizáló enzimmel való kezeléssel és/vagy váltakozó lefagyasztással és újraf elengedéssel; Az oldhatatlan alkotórészek lecentrifugálása; A DNS kicsapása polietilénaminnal; A fehérjék kicsapása ammónium-szulfáttal; Az oldott csapadék affinitás-kromatográfiája monoklonális anti-deszulfatohirudin-antitest-OBzlopon vagy trombin-oszlopon; Az így kapott oldat sómentesitése dialízissel vagy Sephadex G 25 vagy Sephadex G 10 kromatográfiával. Alternatív módon a DNS elválasztása után a bakteriális fehérjéket 0,1%-os ecetsavval kicsaphatjuk, a savas felülúszóból a hirudint n-butanollal extrahálhatjuk vagy a savas felülúszót közvetlenül ioncserélő kromatográfiának (például DEAE 53 dietil-amino-etil-cellulózon) vethetjük alá. További tisztítási lépésnek számit a Sephadex G 50 (vagy 75)-el végzett gélszűrés és a fordított fázisú HPLC. A sómentesités ismét sephadex G 25-n történik. A hirudin-aktivitás kimutatására az anti-hirudin- vagy anti-deszulfatohirudin-antitestekkel (például házinyúlból kapható, vagy hibridomasejtekból kapható monoklonális antitestek) végzett teszt, a trombin-teszt (15) vagy a véralvadási teszt (16) használható. Az eljárás szerint előállítható hirudinvegyületeket önmagában ismert módon más hirudinvegyületekké alakíthatjuk. így például a (XIV) általános képletű vegyületet - a képletben W jelentése Tyr - tirozin-szulfo-transzferázzal, mint például piócasejtekből kapunk, reagáltatva olyan (XIV) általános képletű vegyületté alakíthatjuk, ahol a képletben W jelentése Tyr (-OSOaH). Továbbá például olyan (XIV) általános képletű vegyületeket, ahol a képletben V jelentése Met-Val, olyan (XIV) általános képletű vegyületekké alakíthatunk, ahol a képletben 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
