202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202287 B 2 A 14. ábra vázlatosan mutatja egy a fenti 39bp fragmenst, továbbá a Pv«I-tőI 5du3A-ig terjedő 265bp PGK-5’-szegélyező szekvenciát (lásd 11. ábra és egy az X&al-hellyel szomszédos EcoRI helyet tartalmazó 300bp fragment felépítési módját. A 15. ábra az 1500bp PGK promoter-fragmen (Hindűl/EcoRl) felépítési módját szemlélteti vázlatosan; ez a ffagmen a 14. ábrán vázolt módon felépített fragmens mellett egy Hindül-tól Pvul-ig terjedő 1300bp fragmenst is tartalmaz a PGK-5’-szegélyező szekvbenciából (lásd 11. ábra). A 16. ábra egy humán immuninterferon élesztőben történő expressziójára alkalmas expressziós vektor összetételét szemlélteti; ez a vektor a módosított PGK-promotert, az IFN-y cDNS-t és az élesztő-PGK- gén terminátor- tartományát tartalmazza, amint ezt az alábbiakban részletesebben ismertetjük. Az eljárás részletes leírása A. Az IFN-y mRNS eredete Perifériális vér-limfocitákat (PBL) emberi donoroktól szereztünk leukoforézis útján. A PBLs-t Ficoll-hypaque gradiens- centrifugálással tisztítottuk tovább, majd 5xl06 sejt/ml koncentrációig tenyésztettük egy 1% L-glutamint, 25 mM HEPES-t és 1% penicillin-sztreptomicin-oldatot (Gibco, Grand Island, N. Y.) tartalmazó RPMI 1640 táptalajon. Ezeket a sejteket azután nitrogén staphylococcus-enterotoxin B (1 pg/ml) segítségével indukáltuk IFN-y termelésére 24- 48 óra hosszat tenyésztettük őket 37 "C hőmérsékleten, 5% CO2 jelenlétében. A PBL-tenyészethez 0,1 pg/ml dezacetiltimozin-a-l-et adtunk az IFN-y aktivitás viszonylagos hozamának növelése céljából. B. A messenger-RNS elkülönítése Az összRNS-nek a PBL kultúrákból való extrakcióját lényegileg az S. L. Berger és munkatársai (33) által leírt módszerrel végeztük. A sejteket centrifugálással tömörítettük, majd 10 mmól/1 nátrium-kloridot, 10 mmól/1 trisz-hidrokloridot (pH=7,5) 1,5 mmól/1 magnézium-kloridot és 10 mmól/1 ribonukleozid-vanadil-komplexet tartalmazó oldatban újra szuszpendáltuk őket. NP-40 (1%-os végkoncentrációban) való hozzáadásával lizáltuk a sejteket és a sejtmagokat centrifugálással tömörítettük. Az összRNS-t a szupematáns folyadék tartalmazta, ezt fenollal és kloroformmal való többszöri extrakcióval tisztítottuk tovább. A vizes fázishoz nátrium-kloridot adtunk 0,2 mól/1 koncentrációig, majd kétszeres térfogatú etanol hozzáadása útján az összRNS-t leválasztottuk. Az indukálatlan (nem-stimulált) kultúrákból ugyanezzel a módszerrel választottuk le az RNS-t. Oligo-dT cellulóz-kromatográfiát alkalmaztunk az mRNS-nek a teljes RNS-készítményekből történő tisztítására (34). 1-2 liter PBL kultúrából 5-10 mg összes RNS és 50-200 pg Poly(A)+RNS volt általában kinyerhető. C. Az mRNS méret szerinti frakcionálása Kétféle módszert alkalmaztunk az mRNS-készítmények frakcionálására. Ezeket a módszereket egymástól függetlenül (tehát nem együttesen) alkalmaztuk; mindkettővel az IFN-mRNS szignifikáns mértékű dúsítását értük el. Az mRNS frakcionálására elsősorban formamid denaturálószer jelenlétében történő szacharóz-grádiens centrifugálást alkalmaztunk. 70%-os formamidban 5%-tól 25%-ig menő szacharóz- grádienssel (32) centrifugáltunk 154 000 g-vel, 20 °C hőmérsékleten, 19 óra hosszat. 0,5 ml-es egymásutáni frakciókat vezettünk el a gárdiens tetejéről, ezeket etanollal lecsaptuk és egy-egy hányadrészt Xenopus laevis oocitákba injektáltunk az mRNS transzlációja céljából (35). 24 óra hosszat inkubáltunk szobahőmérsékleten, majd az inkubációs közeget vírusellenes aktivitásra vizsgáltuk a standard citopátiás hatás-gátlási módszerrel, vezikuláris sztomatitisz-vírus (Indiana-törzs), vagy enkefalomiokarditisz-vírus WISH (humán amnion) sejteken, a Stewart (36) által leírt módon, azzal az eltéréssel, hogy a mintákat 4 óra helyett 24 óra hosszat inkubáltuk a sejtekkel a vírussal történő fertőzés előtt. Minden esetben két aktivitásértéket figyeltünk meg a szacharóz-gradienssel frakcionált RNS-sel (1. ábra). Az egyik csúcs 12S számított méretnek megfelelően ülepedett és 1 mikrogramm injektált RNS-re számítva 100-400 egység/ml vírusellenes aktivitást tartalmazott (egy IFN-a standardhoz viszonyítva). A másik csúcs 16S méretnek megfelelően ülepedett és körülbelül fele akkora aktivitást mutatott, mint az előbbi, lassabban ülepedő csúcs. Úgy látszik, hogy mindkét aktivitási csúcs IFN-y-tól származik, mert ha ugyanezeket a frakciókat MDBK marha-sejtvonalonvizsgáltuk (amelyet a humán IFN-y tudvalevőleg nem véd), akkor nem tapasztaltunk semmi aktivitást. Ha viszont IFN-a aktivitás illetőleg IFN-ß aktivitás lett volna jelen, ez az MDBK próbával (5) könnyen kimutatható lett volna. 200 pg mRNS-t elektroforézissel is frakcionáltunk, savas karbamid-agaróz gélen keresztül. Az agaróz gél-lemez (37, 38) 1,75% agarózt, 0,025 mól/1 nátrium-citrátot (pH-3,8) és 6 mól/1 karbamidot tartalmazott. Az elektroforézist 25 milliamper árammal, 4 °C hőmérsékleten, 7 óra hosszat végeztük. A gélt ezután borotvapengével szeleteltük frakciókra. Az egyes szeleteket 70 °C hőmérsékleten megolvasztottunk, majd fenollal kétszer, kloroformmal pedig egyszer extraháltuk. A frakcióat ezután etanollal lecsaptuk, majd Xenopus laevis oocitákba történő injekció és vírusellenes próba útján vizsgáltuk IFN-y mRNS tartalomra. A gél-frakció mintákban csupán egyetlen aktivitásértéket találtunk (2. ábra). Ez a csúcs a 18S RNS-sel együtt migrált és az injektált RNS 1 mikrogrammjára számítva 600 egység/ml aktivitást mutatott. Ez az aktivitás is specifikusan IFN-y aktivitásnak mutatkozott, mintogy az MDBK sejteknek nem nyújtott védelmet. A szacharóz-grádienssel történő frakcionálás aktivitás- csúcsértékei (12S és 16S) és a savas karbamid-gélen történő frakcionálás aktivitásértéke (18S) közötti eltérés azzal a megfigyeléssel magyarázható, hogy ezeket az egymástól független frakcionálási módszereket nem végeztük teljesen denaturáló körülmények között. D. IFN-y szekvenciákat tartalmazó kolónia-„könyvtár” előállítása 3 pg gélen frakcionált mRNS-t alkalmaztunk kettősszálú cDNS standard eljárásokkal (26, 39) történő előállítására. A cDNS-t méret szerint frakcionáltuk 6%-os poliakrilamid gélen. Elektroelúció útján két méret szerinti frakciót kaptunk, 800-1500 bázis-párral 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
