202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202287 B 2 genomiális DNS EcoRI emésztési termékkel szemben. Ehhez a próbához csak a 2,0 kbp EcoRI fragmens hibridizált, ami arra mutat, hogy ez a fragment a 3’-lefordítatlan szekvenciát tartalmazza, míg a 8,8 kbp EcoRI fragmens tartalmazza az 5’-lefordítatlan szekvenciát. Az IFN-y gén szerkezete (egy gén, legalább egy intronnal) határozottan eltér az IFN-a [több gén (2) intronok nélkül (56)] és az IFN-ß-tol [egy gén intronok nélkül (57)]. J. Baktérium-kivonatok készítése Az E. coli W3110 pIFN-y trp 48 törzs éjjelen át inkubált kultúráját pIFN-y trp 48 hozzáadásával (Luria húsfőzet+5 pg/ml tetraciklint tápközegben) alkalmaztuk egy 0,2% glükózt, 0,5% kazaminosavat és 5 pg/ml tetraciklint 1:100 hígításban tartalmazó M9 tápközeg (58) beoltására. Ehhez azután indol- akrilsavat adtunk 20 pg/ml végkoncentrációig, amikor az A550 érték 0,1 és 0,2 között volt. A550-l,O-nál centrifugálás útján 10 ml-es mintákat dolgoztunk fel és a kinyert terméket azonnal újra szuszpendáltuk 1 ml foszfát puffer sóoldatban, amely 1 mg/ml marha szérum-albumint tartalmazott (PBS-BSA). A sejteket szonikálás útján feltártuk és a sejt-törmelékeket centrifugálással eltávolítottuk. Az elkülönített szupematáns oldatot a további feldolgozásig 4 °C hőmérsékleten tároltuk. A szupematáns oldatok interferon-aktivitását IFN-a standardokkal való összehasonlítás útján a citopátiás hatást (CPE) gátlási próbával határoztuk meg és 250 egység/ml-nek találtuk. K. Élesztő-törzsek transzformációja és közegek Az élesztő-törzsek transzformációja az irodalomban (59) leírt módszerekkel történt. Az E. coli JA300 (thr LeuB6 thi thyk trp (1117) hsdtrr hsdR' strR) törzsek (20) alkalmaztuk funkcionális TRPI gént tartalmazó plazmidok szelektálására. Az (a trp 1 gall SUC2 mal CUP I) genotípusú RH21 8 élesztő-törzset alkalmaztuk élesztőtranszformálására gazdaszervezetként. Az RH218 törzset az American Type Culture Collection gyűjteményében ATCC 44076 sz. alatt helyeztük letétbe korlátozás nélkül. A Miller (58) által leírt M9 minimális tápközeget 0,25% kazaminosav (CAA). LB dús tápközeggel és 20 pg/ml, ampicillin hozzáadásával autoklávban sterilizátuk és lehűtöttük. Az élesztő szaporítására 1% élesztőkivonatot, 2% peptont és 2% glükózt ±3% Difco agart tartalmazó YEPD tápközeget és 6,7 g/1 aminosavak nélküli élesztő- nitrogénbázist (YNB, Difco), 10 mg/1 adenint, 10 mg/1 uracilt, 5 g/1 kazaminosavat (CAA), 20 g/1 glükózt és ± 30 g/1 agart tartalmazó YNB+CAA tápközeget alkamaztunk. L. Élesztő expressziós vektorfelépítése 1. lOpg Yrp7-et (14, 15, 16) EcoRI enzimmel kezeltük. A kapott tapadó DNS-végeket DNS-polimeráz I (Klenow-fragmen) alkalmazásával tettük tompákká. A vektrot és az inszertumot 1%-os agaróz-gélen (SeaKem) futtatuk, kivágtuk a gélről, elektroeluáltuk, egyenlő térfogatú kloroform és fenol elegyével kétszer extraháltuk, majd etanollal kicsapatuk. A kapott tompavégű DNS-molekulákat 50 ml végtérfogatban 12 óra hosszat ligáltuk 12 “C hőmérsékleten. Ezt a ligációs elegyet használtuk fel azután az E. coli JA300 törzs transzformálására ampicillin-rezisztenciára és triptofán-prototró. A TRPI gént mindkét orientációban tartalmazó palzmidokat különítettünk el. A pFRWl plazmid a TRPI gént ugyanolyan orientációban tartalmazta, mint az Yrp7, míg a pFRW2 plazmid a TRPI gént az ellenkező orientációban tartalmazta. 20 ug pFRW2 plazmidot HindIU-mú linearizáltunk és 1%-os agarózgélen elektroforizáltuk. A lineáris molekulákat eluáltuk a gélről és 200 ng-ot a pBl plazmid (13) 3.1 kb HindUl inszertumának 500 ngjával kapcsoltunk (ez utóbbi egy restrikciós fragmens, amely az élesztő 3-foszfoglicerát-kináz génjét tartalmazza). A ligációs elegyet hasnáltuk fel azután az E. coli 294 törzs ampicilin-rezisztenciára és tetraciklin- szenzitivitásra való transzformálására. Az egy ilyen rekombinánsból előállított plazmid egy intakt TRPI gént tartalmazott, a pBl betét-DNS 3.1 kbp HindlU fragmentjével a tetraciklin-rezisztencia gén Hindin helyén. Az így kapott termék a pFRM31 plazmid. 5 pg pFRM31 plazmidot teljesen lebontottuk EcoRI enzimmel; a terméket fenollal és kloroformmal kétszer extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk. A kapott molekula kohezív végeit DNS-polimeráz I (Klenow fragmens) alkalmazásával betöltöttük, oly reakcióelegyben, amelyben mindegyik dezoxinukleozid-trifoszfátot 250 pmól koncentrációra állítottuk be. A reakciót 20 percig folytattuk 14 °C hőmérsékleten, ekkor a DNS-t fenol és kloroform elegyével kétszer extraháltuk és etanollal kicsaptuk a terméket. Az újból szuszpendált DNS-t azután Clal enzimmel teljesen lebontottuk, majd 6%-os akrilamidgélen elektroforizáltuk. A vektor-fragmenst eluáltuk a gélről, fenol és klorform elegyével extraháltuk és etanollal kicsaptuk. A humán eredetű tisztított 3-foszfoglicerát enzim hat N-terminális aminosava a következő volt: 1- 2 - 3-4 - 5-6 SER - L'EU - SER - HSM - LYS - LEU - A belső Hindi helyet tartalmazó 141 bp Sau 3A-Sau 3A restrikciós fragmens (lásd a PGK restrikciós térképet a 11. ábrán) DNS-szekvenciájából kapott transzlációs leolvasófázisok egyike az alábbi aminosav-szekvenciát képezi: 1-2-3 - 4- 5- 6 Met - SER - LEU - SER - SER - LYS - LEU - A kezdeti metoinin eltávolítása után látható, hogy a PGK N-terminális aminosav-szekvenciájának 6 aminosava közül 5 homológ a humán PGK N-terminális aminosav-szekvenciájával. Ez a szekvencia-meghatározási eredmény arra mutat, hogy a pBl plazmid 141 bp Sau3A restrikciós fragmensében a DNS az élesztő-PGK szerkezeti gén kezdeti szakaszát kódolja. Korábbi kutatások (20) azt mutatták, hogy a PGK mRNS-t képező DNS-szekvenciák a HindUl fragmens tartományában foglalhatnak helyet. A 141 bp Sau3A fragmens további szekvencia-képzése a PGK promoter több DNS-szekvenciáját eredményezte (12. ábra). Egy 5’Ari'lGTTGTAAA3’ szekvenciájú szintetikus oligonukleotidot szintetizáltunk a szokásos módszerekkel [vö.: Crea és munkatársai: Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980)]. E primer 100 ng-ját az 5’-végnél 32P-vel jeleztük 10 egység T4 plinukleotid-kináz alkalmazásával egy 200 pCi [y^-P] ATP-t is tartalmazó 20 pl reakcióelegyben. Ezt a jelölt primer-oldatot 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
