202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202287 B 2 A találmány a rekombináns DNS technológia területére vonatkozik; tárgyát a humán immuninterferon DNS-szekvenciának és levezetett aminosav-szekvenciájának felderítésére alkalmas technológiai eszközök és módszerek, valamint azoknak a humán immun interferon előállítására való alkalmazása képezi. Közelebbről megjelölve, a találmány a humán immuninterferont kódoló DNS-szekuenciák elkülönítésére és azonosítására, valamint ilyen DNS-szekvenciákat tartalmazó és az expressziót eszközlő promoter-szekvenciákhoz működőképesen kapcsolt rekombináns DNS expresszió-hordozók felépítésére és az így felépített expresszió- hordozókra vonatkozik. Vonatkozik másrészről a találmány az íyen expresszióhordozókkal transzformált és így a fent említett DNS- szekvenciák expressziójára irányított gazdasejt-kultúra rendszerekre, így például különféle ilymódon transzformáit mikroorganizmus- és emlősállat-sejtkultúrákra is. A találmány körébe tartozik továbbá az említett expresszió végtermékeinek átalakítása különféle új termékekké, úgy mint emberek megelőző kezelésére és gyógykezelésére alkalmas gyógyszerkészítményekké. A találmány előnyös kiviteli alakjai olyan különleges expresszióhordozókra vonatkoznak, amelyek humán immun interferon termelésre és a gazdasejtből érett alakban történő kiválasztására képesek. A találmány körébe tartoznak végül az említett DNS-szekvenciák, expresszió-hordozók, sejtkultúra-rendszerek, végtermékek és az azokból képezett további termékek előállítására alkalmazott eljárások is. A jelen találmány alapját elsősorban a humán immuninterferont kódoló DNS-szekvenciának és levezetett aminosav-szekvenciának a felismerése képezte. A találmányt megalapozó további felismerés a humán immuninterferon 3’- és 5’- szegélyező szekvenciájának felderítése volt, ami megkönnyítette annak in vitro bekapcsolását expresszió-hordozókba. így előállítottuk a feltételezett endogén szignál-polípeptidet kódoló 5’-DNS-szekvenciát, amely közvetlenül megelőzi a feltételezett érett humán immuninterferont. Ezek a felismerések viszont lehetővé tették azoknak az eszközöknek és módszereknek a kifejlesztését, amelyekkel a rekombináns DNS-technológia útján annyi humán immun interferont állítottunk elő, amennyi elegendő volt e termék biokémiai tulajdonságainak és bioaktivitásának a meghatározására. A találmány hátterének megvilágítására, valamint az eljárás egyes lépéseinek leírása során további részletes adatokra vonatkozólag számos helyen utalunk a korábbi irodalomra; a szövegben zárójelben álló számok a leírás végén közölt bibliográfiára utalnak. A találmány technikai háttere A. Humán interferon A humán interferonok különböző antigén hatásuk, valamint biológiai és biokémiai tulajdonságaik alalpján három csoportba sorolhatók. Az első csoportba a leukocita-interferonok családja (a-interferon, LelF vagy IFN-a) tartozik; ezeket rendes körülmények között főként az emberi vért alkotó sejtek termelik, vírusok általi indukció hatására. Ezeket már előállították mikrobiológiai úton is és biológiailag aktívnak találták őket (1, 2, 3). Biológiai tulajdonságaik alapján klinikailag is alkalmazták őket vírusos fertőzések és rosszindulatú megbetegedések gyógykezelésére (4). A második csoportba a humán fibroblaszt-interferon (ß-interferon, FTF vagy IFN-ß) tartozik, ezt rendes körülmények között a fibroblasztok termelik, vírusos indukció hatására; szintén előállították már mikrobiológiai úton és azt tapasztalták, hogy biológiai aktivitások széles körét fejti ki (5). Klinikai kísérletek alapján gyógyászati felhasználás is lehetségesnek látszik. A leukocita- és a fibroblaszt- interferonok biológiai tulajdonságaik szempontjából igen határozott hasonlóságot mutatnak, annak a ténynek az ellenére, hogy aminosav-szintjük homológia-foka viszonylag alacsony. Emellett az e két csoportba tartozó interferonok egyaránt 165-166 aminosavat tartalmazó és savakkal szemben stabil fehérjék. A harmadik csoportba sorolható és a jelen találmány tárgyát képező humán immuninterferon (IFN-y) vagy más néven humán gamma-interferon az a- és ß- interferonokkal ellentétben a pH 2-nél labilis; ezt az interferont limfociták termelik mitogén indukció hatására s antigén tulajdonságai szempontjából is határozottan eltér az előbbiaktől. A humán immun interferont egészen a legutóbbi időkig csak igen kis mennyiségekben sikerült kimutatni és az a körülmény nyilvánvalóan gátolta közelebbi jellemzését. Legutóbb a humán immuninterferon eléggé messzemenő, de még mindig csak részleges tisztításáról számoltak be (6). A közlés szerint a vegyületet fitohemagglutin és forbol-észter kombinációjával gerjesztett leukocitakultúrák termelték és sorozatos kromatográfiai elválasztásokkal tisztították a terméket. Ez az eljárás egy 58 000 molekulatömegű terméket eredményezett. Igen kis mennyiségekben állítottak elő humán immuninterferont mRNS oocitákban történő transzlációja útján; ez a termék a humán immuninterferonra jellemező interferon-aktivitást mutatott és a szerző véleménye szerint remélhető, hogy az immuninterferon cDNS szintetizálható és klónozható (7). Az immuninterferon eddig előállított mennyiségei bizonyára nem elegendőek ahhoz, hogy egyértelmű eredményeket adó kísérleteket lehessen folytatni a tisztított termék jellemzésére és biológiai tulajdonságainak meghatározására. Azonban a nyers készítményekkel lefolytatott in vitro kísérletek, valamint az egér-y- interferon készítményekkel folytatott in vivo kísérletek arra mutatnak, hogy az immuninterferon elsődlegesen valószínűleg immun-szabályozó szerként szerepel (8, 9). Az immuninterferonnak nem csak vírus-ellenes és anticelluláris aktivitása van (ami valamennyi humán interferon közös tualjdonsága), hanem fokozni is képes az a- és ß-interferon ilyen irányú hatását (10). Emellett egyes közlések szerint a y-interferon tumor-sejtekkel szembeni sejtszaporodást gátló hatása körülbelül 10- 100-szorosan nagyobb, mint az egyéb csoportokba tartozó interferonoké (8, 11, 12). Ezek a megállapítások, az immuninterferon határozott immun-szabályozó szerepével (8, 9) együtt arra mutatnak, hogy az EFN-y sokkal határozottabb tumor-ellenes hatással rendelkezik, mint az IFN- ct és IFN-ß. Valóban, az egér-IFN-y készítményekkel in vivo folytatott kísérletek azt mutatták, hogy ennek az immuninterferonnak a hatása határozottan felülmúlja a vírus-ellenes indukált egyéb interferonok tumorellenes hatását oszteogén szarkóma ellen (13). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
