202285. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-treonin előállítására fermentálással
1 HU 202285 B 2 A találmány tárgya eljárás L-treonin előállítására az Escherichia nemzetséghez tartozó mikroorganizmust használva, amely rezisztens a rifampicinre, lizinre, metioninra, aszparaginsavra és homoszerinre és L-treonint képes termelni. Az L-treonin nemcsak mint gyógyszer, így aminosav-készítmény, stb. használható, de alkalmazható mint adalékanyag is állati takarmányhoz. Az L-treonin fermentálással végzett előállítására különböző eljárások váltak ismeretessé, így például egy eljárás, amely az Escherichia nemzetséghez tartozó, borrelidinre érzékeny mikroorganizmust használ [6752/76 számú nyilvánosságra hozott vizsgált japán szabadalmi bejelentés], egy másik eljárás, amely az Escherichia nemzetséghez tartozó, növekedéséhez diamino-pimelinsavat és metionint igénylő mikroorganizmust használ és amelynek treonin-bioszintézis rendszere rezisztens a treonin visszacsatoló gátlására [10037/81 számú nyilvánosságra hozott, vizsgált japán szabadalmi bejelentés], egy olyan eljárás, amely a Serratia nemzetséghez tartozó, kevés treonin-dehidrogenázt tartalmazó, a treonin metabolkus antagonistára rezisztens mikroorganizmust alkalmaz [48195/77 számú nyilvánosságra hozott, vizsgált japán szabadalmi bejelentés], egy eljárás, amely a Corynebacterium nemzetséghez tartozó, az alfa-amino-béta-hidroxi-valeriánsavra és az S-(2-amino-etil)-L-ciszteinre rezisztens és metionint igénylő mikroorganizmust használ [19087/72 számú nyilvánosságra hozott, nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés], egy másik eljárás, amely a Brevibacterium nemzetséghez tartozó, az alfa-amino-béta-hidroxi-valeriánsavra és az S-(2-amino-etil)-L-ciszteinre rezisztens és leucint igénylő mikroorganizmust használ [31093/75 számú nyilvánosságra hozott, nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés], továbbá egy eljárás, amely a Brevibacterium nemzetséghez tartozó, az alfa-amino-béta-hidroxi-valeriánsavra és az S-(2- amino-etil)-L-ciszteinre rezisztens és L-izoleucint és L- lizint igénylő mikroorganizmust alkalmaz [224 684/83 számú nyilvánosságra hozott, nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés]. A találmány szerint az L-treonint nagy kitermeléssel és kis költséggel tudjuk előállítani úgy, hogy az Escherichia coli fajhoz tartozó olyan mikroorganizmust használunk, amely képes L-treonint termelni és emellett rezisztens a rifampicinre, lizinre, metioninra, aszparaginsavra és homoszerinre. A találmány tárgya eljárás L-treonin előállítására fermentálással oly módon, hogy az Escherichia coli fajhoz tartozó, rifampicinre, lizinre, metioninra, aszparaginsavra és homoszerinre rezisztens, L-treonint termelni képes mikroorganizmust táptalajban addig tenyésztünk, amíg az L-treonin a tenyészetben felszaporodik és az L-treonint a tenyészetből kivonjuk. A találmány szerinti eljárásban bármely mikroorganizmus használható, amennyiben az Escherichia coli fajhoz tartozik és rezisztens a rifampicinre, lizinre, metioninra, aszparaginsavra és homoszerinre és magvan az a képessége, hogy L-treonint termeljen. Rifampicinre, lizinre, metioninra, aszparaginsavra és homoszerinre rezisztens törzseket úgy állíthatjuk elő, hogy egy Escherichia coli fajhoz tartozó, L-treonint termelő mikroorganizmust az említett reziszfencia-tulajdonságokkal a szokásos mutációs eljárásokkal sorjában felruházunk. A rezisztencia-tulajdonságok biztosításának rendjét nem kell megállapítani, és bármely rezisztencia-tulajdonság megelőzhet más rezisztencia-tulajdonságokat. Előnyös mikroorganizmus például az Escherichia coli H-4581. Az Escherichia coli faj L-treonint termelő mikroorganizmusainak megvan az az előnye, hogy kevés melléktermék aminosavat termelnek. A fent említett rezisztens törzs előállítására az alábbi specifikus példát adjuk meg. Escherichia coli H-4257 (FERM BP-984) mikroorganizmust (amely diamino-pimelinsavat és metionint igényel, rezisztens az alfa-amino-béta-hidroxivaleriánsavra és csökkent mértékben degradálja az L-treonint) szokásos mutációs kezelésnek vetünk alá N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel (NTG) (200 jig/ml, 30 °C, 30 perc) és ezután 100 pg/ml rifampicint tartalmazó minimál táptalajra (0,5% glükóz, 0,1% (NH4)2S04, 0,2% KH2P04, 0,7% K2HPCU, 0,1 g/liter MgSÓ4.7H20, 20 mg/liter Fe2(S04)3, 50 mg/liter diamino-pimelinsav, 50 mg/liter metionin és 2% agar, pH=7,2) kenjük és 30 °C-on 2-6 napig tenyésztjük, így ezen a táptalajon tenyészhető, rifampicin-rezisztens mutáns telepeket kapunk. Ezután 50 mutáns törzset kiszúrunk és ezeket L-treonin termelési tesztnek vetjük alá, hogy kiválasszuk az L-treonint legjobban termelő törzset. Az így kapott törzset a fentiekben ismertetett mutációs kezelésnek vetjük alá és felkenjük az említett minimál táptalajra, azzal az eltéréssel, hogy ez rifampicin helyett 15 g/liter lizint tartalmaz. A tenyésztést a fentiekben ismertetett módon végezzük, s így ezen a táptalajon tenyészthető lizin-rezisztens mutáns telepeket kapunk. A telepekből 50 mutáns törzset kiszúrunk és ezeket L-treonin termelési tesztnek alávetjük. A legtöbb L-treonint termelő törzzsel a műveletek sorát a mutációs kezeléstől az L-treonin termelési tesztig háromszor megismételjük, a lizint sorjában 15 g/liter metioninnal, homoszerinnel, illetve aszparaginsavval helyettesítve. Az így kiválasztott H-4581 törzset, mint rifampicin-, lizin-, metionin-, homoszerin- és aszparaginsav-mutánst deponáltuk (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japán, 1987. július 16-tól, a FERM BP-1411 letéti számon). Az L-treonint a fenti mikroorganizmus tenyésztésével állítjuk elő szintetikus vagy természetes táptalajban, amely szénforrásokat, nitrogénforrásokat, szervetlen sókat, növekedési faktorokat és hasonlókat tartalmaz. A tenyésztést addig folytatjuk, amíg az L-treonin a tenyészetben felszaporodik, ezután az L-treonint a tenyészetből kivonjuk. Szénforrásokként használhatók szénhidrátok, így glükóz, fruktóz, melasz, keményítő-hidrolizátum stb., és szerves savak, így ecetsav, propionsav, hangyasav, fumársav, almasav, stb. Nitrogénforrásokként használhatók az ammónia, a szervetlen vagy szerves savak ammóniumsói, így az ammónium-klorid, ammónium-szulfát, ammóniumacetát, ammónium-foszfát, aminok, más nitrogéntartalmú vegyületek, peptonok, húskivonatok, kukoricalekvár, kazein-hidrolizátum, szójababpogácsa-hidrolizátum, különböző fermentációs sejtek és ezek emésztett termékei stb. Szervetlen vegyületekként alkalmazhatók a kálium-dihidrogén-foszfát, dikálium-hidrogén-foszfát, magnézium-foszfát, magnézium-szulfát, nátrium-klo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
