202283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karbonsavészterek előállítására enzimreakció útján
1 HU 202283 B 2 Az így kapott szerves oldatot 3 literes Erlenmeyer lombikba visszük át, nátrium-szulfáton 2 órán át szárítjuk, majd vákuumban szárazra pároljuk. így nyers, kristályos alakban 10 g lankacidin A-t kapunk. Az így kapott nyers terméket 1 liter kloroformban oldjuk, és az oldatot 500 mm hosszúságú, 80 mm átmérőjű szilikagél-oszlopon (Merck Co., USA gyártmánya) vezetjük át. Az oszlopot előzőleg kloroformmal egyensúlyozzuk. Ezután 2 liter ldoroformmal mossuk az oszlopot, majd az eluálást etil-acetát és kloroform 3:7 térf./térf. arányú elegyével végezzük. Frakció- kollektorban (Toyo 5F-160K típusú) 20 ml térfogatú frakciókat fogunk fel, s a lankacidin A-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. A lankacidin A-t UV spektroszkópiával mutatjuk ki. Az így kapott oldatot vákuumban szárazra párolva a lankacidin A-t poralakban kapjuk. Ehhez a porhoz 1 liter etil-acetátot adunk, az így kapott oldatot vákuumban 40 ml-re töményítjük, és utána 5 'C-on hűtjük. Az így kivált lankacidin A kristályokat üvegszűrőre gyűjtjük, n-hexánnal mossuk, és 2,7 kPa nyomáson 40 'C hőmérsékleten szárítjuk, így 8,1 g kristályos lankacidin A-t kapunk. Igazoltuk, hogy az így kapott kristályos termék olvadáspontja, optikai forgatóképessége, UV színképe és elemanalízise azonos a Journal of Antibiotics 24, 13 (1971) irodalmi helyen leírt vegyület megfelelő adataival. Igazoltuk továbbá, hogy az így kapott kristályos termék retenciós ideje a HPLC-módszer alkalmazása során azonos egy autentikus lankacidin A minta retenciós idejével. 4. példa: Lankacidin A előállítása 10 literes, üvegbélésű, keverővei felszerelt reaktorba 2 liter metil-izobutil-ketont mérünk, amely 37 °C hőmérsékleten 10 g lankacidin C-t tartalmaz oldott állapotban. Ehhez az oldathoz az 1. referencia-példában kapott karboxil-észteráz-készítmény 1 liter térfogatú oldatát adjuk, amelyet 0,2 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-maleinsav pufferoldattal (pH 7,0) készítettünk; a karboxil-észteráz készítmény koncentrációja ebben az oldatban 2 mg/ml. Az elegyhez 10 ml ecetsavanhidridet adunk, majd 37 °C hőmérsékleten 40 percig keverjük. Ezután 2 liter desztillált vizet adunk hozzá, alaposan átkeverjük, majd 10 literes választótölcsérbe visszük át. A 3. példában leírt feldolgozást követve 5,8 g kristályos lankacidin A-t kapunk. 5. példa: Lankacidin A előállítása Az 1. referencia-példában említett Streptomyces rochei var. volubilis tenyésztésével kapott kultúra szűrlete a Streptomyces rochei var. volubilis-ból származó karboxil-észteráz enzimet tartalmaz. Ismert, hogy a Streptomyces rochei var. volubilis képes lankacidin C felhalmozására a táptalajban, azaz a Streptomyces rochei var. volubilis mikroorganizmus képes lankacidin C termelésére [The Journal of An- 5 tibiotics 24, 1 (1971)]. A kultúra szűrletének lankacidin C tartalmát az 1. példában leírt HPLC-módszerrel mértük meg. Kimutattuk, hogy ez a szűrlet a lanakcidin C-t 3500 pg/ml koncentrációban tartalmazza. 10 Az 5. példában az 1. referencia-példában kapott kultúra szűrletét alkalmazzuk kiinduló anyagként, amely egyrészt karboxil-észterázt, másrészt hidroxilvegyületet tartalmaz. Keverővei ellátott, 10 literes, üvegbélésű fermentorba 1 liter szűrletet helyezünk, 15 és az elegy hőmérsékletét 37 °C-on tartjuk, majd az elegyhez 1 liter 37 °C hőmérsékletű metil-izobutilketont és 10 ml ecetsavanhidridet adunk, és utána 37 °C-on 60 percig keverjük. Ezután a reakcióelegyet 5 °C hőmérsékleten 2000 x g sebességgel centrifu- 20 gáljuk alacsony hőmérsékletű centrifugális szeparátor segítségével (RD-2 IV típus, Tomy Seiko Co. Ltd., Japán cég gyártmánya). Az így kapott oldatot 10 literes választótölcsérbe visszük, a felső fázist elkülönítjük, és 2 liter desztillált 25 vízzel mossuk. A 3. példában leírt feldolgozást követve 2,8 g lankacidin A-t kapunk. 6. példa: Lankacidin-14-propil-észter előállítása A 3. példában leírt eljárást követjük, azzal a 30 kivétellel, hogy 10 ml ecetsavanhidrid helyett 10 ml propionsavanhidridet alkalmazunk. A reakcióelegy oldószeres fázisában felhalmozódott termékeket az 1. példában leírt HPLC-módszerrel azonosítjuk, és mérjük. Ennek során a Journal of Antibiotics 26, 647 35 (1973) irodalmi helyen leírt szintetikus módszerrel előállított lankacidin-14-propionátot alkalmazzuk autentikus mintaként. A mérés szerint az oldószeres fázis a lankacidin- 14-propionátot (amelynek retenciós ideje 2,40 perc) 40 9,1 g/liter koncentrációban tartalmazza. A 3. példában leírt feldolgozás szerint 7,2 g lankacidin-14-propionátot kapunk elkülönítés és tisztítás után. Az olvadáspont, optikai forgatóképesség, elemanalízis és a molekuláris extinkció értéke alapján 45 ez a tennék azonosnak bizonyult a Journal of Antibiotics 26, 647 (1973) irodalmi helyen leírt vegyülettel. 7. példa: Lankacidin-14-észter előállítása 50 A 6. példában leírt eljárást követve propionsavanhidrid helyett vajsavanhidridet, izovajsavanhidridet, kapronsavanhidridet vagy benzoesavanhidridet alkalmazunk. A reakcióelegyet az 1. példában leírt HPLC- módszerrel vizsgáljuk, az elkülönítést és tisztítást a 55 3. példában leírt módszerrel végezzük. Karbonsavanhidrid Termék Retenciós idő perc g Hozam Vajsavanhidrid Lankacidin-14-n-butirát 2,03 5,70 Izovajsavanhidrid Lankacidin-14-izobutirát 1,89 5,60 Kapronsavanhidrid Lankacidin-14-kapronát 4,06 3,10 Benzoesavanhidrid Lankacidin-14-benzoát 4,90 3,21 7
