202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 MET-ASP-ASP-LYS-bGH, MET-bGH, MET-ASP-bGH, MET-ASP-bGH, MET-VAL- bGH, MET-ALA-PHE-PRO-ALA-MET-SER-LEU-SER-VAL-b’GH ahol MET metíonin, ASP aszparaginsav, LEU leucín, SER szerin, PRO prolin, PHE fenil-alanin, LYS lizin, VAL valin, ALA alanin, b’GH olyan szarvasmarha növekedési hormon természetes amínosav szekvencia, amely a 9., leucin aminosavval kezdődik, továbbá, ahol bGH olyan szarvasmarha növekedési hormon természetes aminosav szekvencia, amely az N-terminális (első) fenil-alaninnal kezdődik. A szemléltető jelleggel bemutatott pCZ112 plazmid restrikciós térképét a mellékelt 10. ábrán adjuk meg. A pCZIOl kiindulási plazmid 10,8 kb nagyságú és úgy állítjuk elő, hogy a pNM789B plazmid 0,6 kb nagyságú Xbal-BamHI fragmensét ligáljuk a hasonlóképpen emésztett pIM-I’-A3 plazmiddal. Az utóbbi plazmid tartalmazza a transzlációs és transzkripciós aktivációs szekvenciáját az E. coli lipoprotein gén működéséhez, tartalmaz egy, a példányszámot meghatározó replikont, a plazmidot magát az E. coli K12RV308/pIM-I’-A3 törzsből kapjuk. Ezt a törzset letétbe helyeztük a Northern Regional Research Laboratory törzsgyűjteményében, Peoria, Illinois. A plazmidot NRRL B-15733 sorszám alatt megrendelhető törzsből izolálhatjuk. A pNM789B plazmid a pKENlll plazmidból származik az 1-8. példában megadottak szerint végzett kísérletek szerint, illetve az 1. példában megadott technikát használva. A pKENI 11 plazmidot az E. coli K12 CC620/pKENlll törzsből izolálhatjuk, a törzset a Northern Regional Research Laboratory törzsgyűjetményében helyeztük letétbe, Peoria, Illinois. A plazmid forrásaként szereplő törzset az alábbi sorszámon tartják nyilván: NRRL B-15011. A pNM789B plazmid szintén tartalmazza az E. coli lipoprotein gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciákat, és ezenkívül egy olyan kódoló szekvenciát a transzlációs stop jellel együtt, amely a BGH-t és a bGH N-terminális végénél elhelyezkedő 9-tagú polipeptidből álló fúziós proteint határoz meg. Az Xbal-BamHI fragmenst tartalmazó és a fúziós proteint leíró kódoló szekvenciát a megfelelően hasított pIM-I’-A3 plazmidhoz ligáivá megkapjuk az előzőekben ismertetett pCZIOl plazmidot. A pNM608 kiindulási plazmid 4,6 kb nagyságú és úgy állítjuk elő, hogy a pHMI7 A4A1 plazmid EcoRI-Clal fragmensét és a pBR322 plazmid Eco- RI-ClaI fragmensét ligáljuk. A pHI7 A4A1 plazmid előállítására a későbbiekben megadottak szerint járunk el (lásd az 5. példát). Mivel a pHI7 A4A1 plazmidban több Taql restrikciós hely van, a szükséges EcoRI-Taql fragmenst úgy állítjuk elő, hogy szubklónozzuk a pHI7 A4A1 EcoRI-Hpal és Hpal-Taql fragmenseket. A pNM608 plazmid tartalmazza az E. coli triptofán transzkripciós aktivációs szekvenciát, és így felhasználható a jelen leírás szerinti eljárásban. A témában jártas szakember felismeri, hogy a fentiekben ismertetett különböző dezoxi-ribonukleinsav linkerek jelentős szerepet játszanak az eljárásban. Ezeket a szekvenciákat ismert módon szintetizáljuk a módosított foszfo-triészter-módszerrel, amelyben teljesen védett didezoxi-ribonukleotid építőköveket használunk. Ezek a szintetikus módszerek jól ismertek, és lényegében az alábbiak szerint végezzük: Itakura és munkatársai, Science, 198, 1056 (1977); Crea és munkatársai, PNAS, USA, 75, 5765 (1978). Különösen előnyös módszert közölnek az alábbi szerzők: Hsiung és munkatársai, Nucleic Acid Research, 11, 3227 (1983), és Narang és munkatársai, Methods in Enzymology, 68, 90 (1980). A használt linkerek kódolnak egy transzlációs aktivációs szekvenciát és aminosavakat, amelyek között szerepel a fentiekben ismertetett bGH-számiazék első része (N-terminális régió). A bGH- t kódoló szekvencia további részét (ebben szerepel a megfelelően elhelyezett transzlációs stop jel), és a transzkripciós aktivációs szekvenciát úgy építjük be, hogy a pCZIOl plazmid megfelelő fragmensét ligáljuk. Ezeknek a ligálásoknak a során a találmány szerinti szarvasmarha növekedési hormon-származékot kifejező plazmidokat kapunk. A pCZIOl plazmid 900 bázispárból álló BstEII restrikciós fragmensének kihasítása, majd az ezt követő recirkularizáció után megkapjuk a pCZ103 jelű plazmidot. A BstEII deléció nem érinti a pCZIOl plazmid bGH-t kódoló régióját. Ha a fenti eljárás során a pCZIOl plazmid helyett a pCZ103 plazmidot használjuk, úgy egy hasonló, de 900 bázispárral kisebb plazmidhoz jutunk. A pCZ103 plazmidból származó vektorok által kifejezett bGH-származékok így azonosak a pCZIOl plazmidból származó származékokkal. Ha a fentiekben ismertetett eljárásban a pJRl és pAT2 előállítása során a pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal és 0,6 kb nagyságú BamHIHgiAI restrikciós fragmensei helyett a pCZ103 plazmid 9,3 kb nagyságú BamHI-Xbal és a 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI restrikciós ffagmenseit használjuk, úgy sorrendben a pJR1.3 és pAT2.3 származék plazmidokat kapjuk. Ha a pCZIOl plazmid 10,2 nagyságú BamHI-EcoRI és 0,6 kb nagyságú BanHIHgiAI restrikciós fragmensei helyett a pATl, pASPl, pASP2, pCZl54, pCZ155, pCZ156 plazmidok fentiekben ismertetett előállítása során a pCZ103 plazmid 9,3 kb nagyságú BamHI-EcoRI és 0,6 kb hagyságú BamHI-HgiAI restrikciós fragmenseit használjuk, úgy sorrendben az alábbi plazmidokhoz jutunk: pAT1.3, pASP2.3, pCZ 154.3, pCZ155.3, továbbá pCZ156.3. A találmány szerinti eljárás semmilyen módon nem limitált egy adott transzkripciós aktivációs szekvencia használatára, mivel egy specifikus szekvencia kiválasztása nem lényeges a találmány szempontjából. Az előzőekben példaként említett lipoprotein és triptofán aktivációs szekvencián kívül például, nem limitálóan, az alábbi transzkripciós aktivációs szekvenciákat használhatjuk: E. coli laktóz (lac), a lambda PlOl és a PrOr bakteriofágok transzkripciós aktivációs szekvenciája. Ezenkívül egy vagy több transzkripciós aktivációs szekvenciát is használhatunk, vagy ezeknek egy részét, egymás mellett, például a trp és lac vagy a tac transzkripciós aktivációs szekvenciákat. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
