202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 C. A pBR322 plazmid emésztése EcoRl-Clal enzimekkel 37 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk az alábbi összetételű reakcióelegyet: 5 pg pBR322 dezoxi-ribonukleinsav, 10 itl Ólai reakcióelegy (100 mmól trisz-hidro-klorid, pH=7,4), 100 mmól magnézium-diklorid, 60 mmól ß-merkapto-etanol, 77,5 ni víz és 7,5 ni (15 egység) Clal restrikciós enzim. A reakció leállítására 5 percen át 70 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet. Jégfürdőben lehűtjük, majd pH=7,2-jű 12,5 ni 1 mólos trisz-hidro-kloridoldatot, 6,25 ni 1 mólos nátrium-klorid-oldatot, 2,5 ni 0,1 mólos magnézium- diklorid-oldatot és 1 ni (10 egység) EcoRI restrikciós enzimet adagolunk hozzá. 1 órán át 37 °C hőmérsékleten, majd 5 percen át 70 °C-on inkubáljuk a reakcióelegyet. Jégfürdőben lehűtjük, majd a kapott dezoxi- ribonukleinsavat 1% agarózt tartalmazó gélen elektroforézissel szétválasztjuk. A nagyobb fragmenst elúcióval izoláljuk, etanollal kicsapjuk, és 20 ni TE-pufferban oldjuk, majd felhasználásig 0 °C hőmérsékleten tároljuk. D. Ligálás és transzformálás A 6. példa A. pontja szerint előállított 253 bázispárból álló EcoRI-Hpal fragmens 0,2 |ig-ját, a 6. példa B. pontja szerint előállított 0,5 ng Hpal-Taql fragmenst és a 6. példa C. pontja szerint előállított 0,1 ng EcoRI- Clal dezoxi-ribonukleinsavat ligálunk, és ezután E. coli K12 RV308 sejtekbe transzformálunk, a 2. példa D. pontja szerint eljárva. A transzformánsok közül néhány, ahogy azt az agaróz gélen végzett elektroforézis [Maniatis és munkatársai (1982)] és más vizsgálatok mutatják, csak a 4,6 kb nagyságú plazmidot hordozzák. Az egyik ilyen transzformánst E. coli K12 RV308/pNM608 jellel jelölünk, szelektáljuk, megfelelő antibiotikumokat tartalmazó TY agaron szélesztjük, és ismert mikrobiológiai technikákat használva tenyésztjük. A pNM608 plazmid izolálás után forrása a pHI7A4Al plazmid 217 bázispárból álló EcoRI-Clal (Taql) fragmensének. 7. példa A pCZ112 plazmid és az E. coli K12 RV308lpCZ112 törzs előállítása A. A pNM608 plazmid emésztése EcoRI-Clai enzimekkel, és a 0,288 kb nagyságú EcoRl-Taql előállítása (azonos a pHl7A4Al plazmid 0,288 kb nagyságú EcoRl-Taql Jragmensével) 5 ng pNM608 dezoxi-ribonukleinsavat inkubálunk 10 egység EcoRI és 10 egység Clal restrikciós enzimmel 37 °C hőmérsékleten, 1 órán át 50 ni alábbi összetételű só- pufferban: 50 mmól nátrium-klorid, 100 mmól trisz-hidro-klorid, pH-7,5, 6 mmól magnézium-diklorid, 2 mmól ß-merkapto-etanol. 5 ni 3 mólos nátrium-acetát-oldatot (ph=7,0) adunk az elegyhez, majd a dezoxi-ribonukleinsavat 3 térfogat 100%-os etanollal kicsapjuk. A dezoxi-ribonukleinsav tenméket 100 ni TE-pufferban oldjuk, és felhasználásig 0 °C hőmérsékleten tároljuk. B. A dezoxi-ribonukleinsav linker szekvencia előállítása Az alábbi linker szekvenciát állítjuk elő: 5’ CGACC ATG GAT GAT AAG TTT CCG III III I I I I I I I I I III III 3’ TGG TAC CTA CTA TTC AAA GGC GCT ATG TCT CTG TCC GGC CTG III III I I I I I I I I I II I III CGA TAC AGA GAC AGG CCG GAC TTT GCC A AC GCT GTGCT 3’ III III III III I AAA CGG TTG CGA C 5’. A szintézist Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) módosított foszfo-triészter módszerével végezzük. A szintézis módszerét az 1. példában részleteztük. C. Ligálás és transzformálás A 1. példa B. pontjában megadott dezoxi-ribonukleinsav linker 20 pM-nyi mennyiségét, 1 ng pNM608 plazmid, a 7. példa A. pontja szerint előállított fragmensét, és 0,5 ng pCZIOl plazmidból származó, 10,2 kb nagyságú BamHI-EcoRI fragmenst, továbbá 1 ng. a 3. példa B. pontja szerint előállított, pCZIOl plazmidból származó, 0,69 kb nagyságú BamHIHgiAI fragmenst ligálunk. A 10,2 kb nagyságú Bam- HI-EcoRI fragmenst a 2. példa B. pontja szerint állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy az Xbal restrikciós enzim és a hozzá tartozó puffer helyet EcoRI restrikciós enzimet és a megfelelő puffert használjuk. A ligálást követően kapott plazmiddal E. coli K12 RV308 sejteket transzformálunk, a 2. példa D. pontja szerint eljárva. A kapott transzformánsok közül néhány az agaróz gélen végzett elektroforézis [Maniatis és munkatársai (1982)] és más vizsgálatok szerint csak az adott 10,8 kb nagyságú plazmidot tartalmazzák. Egy ilyen transzformánst E. coli K12 RV308/pCZ112 jellel szelektáltunk, TY agaron, kanamicin jelenlétében szélesztünk, és ismert mikrobiológiai technikákat használva tenyésztünk. A kapott sejtek az SDS gél-elektroforézis, RIA és más vizsgálatok szerint kifejezik az Met- Asp-Asp-Lys-bGH származékot. A kifejezett termék mennyisége nagy. Mivel a pCZ112 plazmid termoindukálható úgynevezett „runaway” replikont tartalmaz, amely az indukció körülményei között elveszti a plazmid példányszám-szabályozási képességét, 37 °C hőmérsékleten a tenyészetben az adott bGH származék maximális kifejeződése következik be. 8. példa A pATl plazmid és az E. coli K12 RV308/pATl törzs előállítása A 7. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az alábbi dezoxi-ribonukleinsav linker szekvenciát állítjuk elő, a 7. példában megadott helyett: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 23
