202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 F Tetraciklin rezisztenciát meghatározó gén szomszédságában a 3’-végnél PstI szekvenciát, és az 5'végnél Bglll szekvenciát hordozó lineáris dezoxi-ribonukleinsav előállítása A pBR322 plazmidot HindHI enzimmel emésztjük, és a ragadós HindlII végeket SÍ nukleázzal emésztjük. Az SÍ nukleázos kezelést úgy végezzük, hogy 10 pg HindlII enzimmel hasított pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat az alábbi összetételű SI puffer 30 plében oldunk: 0,3 mól nátirum-klorid, 1,0 mmól cink-diklorid, 25 mmól nátrium-acetát, pH-4,5. A reakcióé légyhez 300 egység SÍ nukleázt adunk, és a reakciót 30 percen át végezzük 15 °C hőmérsékleten. A reakció leállítására 1 pl alábbi összetételű, 30X SÍ nukleázt leállító oldatot adunk: 0,8 mól trisz-bázis és 50 mmól etilén-diamin-tetraecetsav. Fenollal, majd kloroformmal extraháljuk az elegyet, a terméket etanollal kicsapjuk, és ezután az előzőekben megadottak szerint EcoRI enzimmel emésztjük. Poliaktil-amid gél-elektrofonézissel és az azt követő elektroelúcióval izoláljuk a fragmenst, ez EcoRI ragadós véggel és egy olyan tompa véggel rendelkezik, amely kódoló szálja timidin nukleotiddal kezdődik. Az SÍ nukleázzal emésztett HindlII szekvencia timidinnel kezdődik, ez egy Klenow polimeráz I enzimmel kezelt Bglll véghez kapcsolható úgy, hogy ligáció után a Bglll enzim által felismerhető szekvencia visszaáll. Úgy járunk el, hogy az 5. példa C. pontja szerint előállított pSOM7A2 plazmidot Bglll enzimmel emésztjük, és a kapott Bglll ragadós végeket Klenow polimeráz I enzimmel feltöltjük a 4 dezoxi-nukelotid-trifoszfát jelenlétében. A kapott terméket EcoRI enzimmel hasítva, majd a kis fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektroelúcióval tisztítva olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav fragmenshez jutunk, amely tartalmazza a triptofán promoter-operátor rendszert, és a Bglll helytől baka eső LE’ proximális (közelebbi) kódonjait [LE* (p)]. A termék EcoRI felismerőhellyel és a Bglll hely feltöltése miatt egy tompa véggel rendelkezik. Bár a Bglll hely bázisszekvenciája visszaáll, az SÍ enzimmel emésztett HindlII fragmens tompa végligációja következtében. A két fragmenst T4 dezoxiribonukleinsav ligáz jelenlétében összekapcsoljuk, amikor pHKYlO jelű plazmidot kapunk, amit E. coli K12 294 sejtekbe transzformálva szaporítunk. A tetraciklinre rezisztens sejtek hordozzák a pHKYlO plazmidot, ezeket szelektáljuk, és a plazmid dezoxiribonukleinsavat extraháljuk. A terméket Bglll és PstI enzimmel emésztjük, poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektroelúcióval izoláljuk a nagyobb fragmenst, amiután PstI és Bglll ragadós végeket tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleinsavat kapunk. A pHKYlO plazmidból származó dezoxi-ribonukleinsav fragmens tartalmazza a repükációs origót, és így felhasználható annak a pHI7A4Al plazmidnak az előállítására, amelyben jelen van a trp LE’ fúziós proteint meghatározó génszekvencia, és trp promoter-operátor rendszer szabályozása alatt álló, tetraciklin rezisztenciát meghatározó gén. G. A trp promoter-operátor rendszert hordozó lineáris dezoxi- ribonukleinsav előállítása Az 5. példa E. pontja szerint előállított pSOM7A2A4 plazmidot EcoRI enzimmel részlegesen, és PstI enzimmel teljesen emésztjük. A kapott fragmens tartalmazza a trp promoter/operátor rendszert, ezt a poliakril-amid gél-elektroforézist követő elektroelúcióval izoláljuk. EcoRI enzimmel részlegesen emésztünk, mivel így kapjuk meg azt a fragmenst, amely a szomatosztatin proteint meghatározó gén 5’-végének közelében van hasítva, de nem hasadt az ampicillin rezisztencia gén és a tip promoter/operátor rendszer között levő EcoRI enzim által felismert szakasz mentén. Az ampicillin rezisztenciát meghatározó gén elveszett az ampicillin rezisztencia génen belül eső PstI felismerő hely vágása következtében, azonban az 5. példa F. pontja szerint előállított lineáris pHKYlO dezoxi-ribonukleinsav-származék ligálásakor ez a szekvencia helyreáll. H. A proinzulin 32 N-terminális aminosavát kódoló szintetikus gén előállítása 18 oligo-nukleotidot állítunk elő (lásd a II. táblázatot) a proinzulin első 32 aminosavát meghatározó gén előállításának első lépéseként. A 14. ábrán mutatjuk be a teljes előállított gén nukleotid-szekvenciáját. II. táblázat A humán proinzulin szintetikus oligo-nukleotidjai Vegyület Szekvencia Hl AATTCATGTT H2 CGTCAATCAGCA H3 CCTTTGTGGTTC H4 T CACCTCGTTGA H5 TTGACGAACATG H6 CAAAGGTGCTGA H7 AGGTGAGAACCA H8 AGCTTCAACG B1 AGCTTTGTAC B2 CTTGTTTGCGGT B3 GAACGTGGTTTC B4 TTCTACACTCCT B5’ AAGACTCGCC B6 AACAAGGTACAA B7 ACGTTCACCGCA B8 GTAGAAGAAACC B9 AGTCTTAGGAGT B10’ GATCCGGCG A 14. ábrán zárójelek között aláhúzva ábrázoljuk a szintetikus nukleotidokat. Ezeket ismert módon állítjuk elő [Crea és munkatársai, J. Bioi. Chem., 250, 4592 (1978) és Itakura és munkatársai, J. Am. Chem. Soc., 97, 7327 (1975)]. Egyes oligo- nukleotidokat felhasználtak az előzőleg leírt humán inzulin Bláncát meghatározó gén előállítására [Crea és munkatársai (1978) és Goeddel és munkatársai (1979)]. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20
