202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
25 HU 202280 B 26 restrikciós endonukleázok hasítási helyei. Minden egyes szintetikus DNS töredék 50 ng mennyiségét foszforileztük. A fo6zforilezett töredékeket elegyítettük, 1 percig 65 °C-on melegítettük, majd hagytuk, hogy szobahőmérsékletre lehűljön, 5 ug pFl DNS-t feltártunk Bgll és BglII enzimekkel, s a 310 bázispárból álló urokináz DNS töredéket különítettük el és tisztítottuk. Körülbelül 50 ng mennyiségű, 310 bázispárból álló urokináz DNS töredéket, mintegy 150 ng mennyiségű, a pHGH207-l plazmid részleges EcoRI emésztésével és BglII emésztésével kapott vektor DNS töredéket (lásd fentebb) és 10 ng foszforilezett és összekevert szintetikus DNS töredékeket elegyítettünk, és összekapcsoltunk őket egy éjszakán át 14 °C-on, majd a termékkel Escherichia coli 294 törzset transzformáltunk. A különböző, ampicilinnel szemben rezisztens transzformációs termékekből elkülönített egyes plazmidok dezoxiribonukleinsavját analízisnek vetettük alá, hogy megerősítsük a nagy mole ku látómé gű urokináz elószekvenciájának megfelelő szerkezetét és nukleotid szekvenciáját. Az egyik megfelelő plazmidnak a plnt4 megjelölést adtuk. 5 Mg plnt4 DNS-t emésztettünk BglII és EcoRV enzimekkel, s elkülönítettük és tisztítottuk azt a vektor DNS töredéket, amely a pre-UK54 nitrogén-végcsoportú nukleotidjait, a trp promotort, az ampicillinnel szembeni rezisztenciát biztositó géneket, a reprodukció eredetét és a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát kódoló DNS egy részét tartalmazta. 5 pg mennyiségű pUK54trp207-l plazmid DNS-t emésztettünk BglII és EcoRV enzimekkel. Az 54 kdalton molekulatömegű urokináz fennmaradó részét kódoló BglII - EcoRV DNS töredéket elkülönítettük, tisztítottuk, és öszszekapcsoltuk a BglII - EcoR vektor DNS töredékkel, hogy ily módon befejezzük a p-preUK54trp207-l plazmid kialakítását. Az (elő)-urokináz közvetlen termelése szövettenyészetben A 11. ábrán vázoltuk a pre-UK (elő-urokináz)-t kódoló gén bevitelét a p342E eukariotikus termelő vektorba (62), amely képes az eló-urokináz reprodukciójára és termelésére COS-7 vonalú majomvese fibroblaszt sejtekben (Gluzman, 32). 10 Mg p342E plazmid DNS-t feltártunk Xbal enzimmel, és körülbelül 100 bázispárt távolítottunk el mindegyik irányban Bal31 nukleáz alkalmazásával. (1. töredék) A foszforsav-triészteres módszerrel (47) szintetizált HindlII 5’ CTCAAGCTTGAG összekapcsoló 100 ng mennyiségét foszforileztük, 1 percig 65 °C-on hevitettük, és hagytuk, hogy lehűljön szobahőmérsékletre. A foszforilezett összekapcsolót és az 1. töredéket összekapcsoltuk egy éjszakán ét 14 °C-on, és a termékkel Escherichia coli 294 törzset transzformáltunk. A pEH3-Ball4 megjelölésű egyik transzformált termék restrikciós endonukleázzal végzett analízise egy HindlII restrikciós endonukleáz hely bevitelét és az Xbal hely elvesztését mutatta. 5 pg mennyiségű pEH3-Ball4 plazmid DNS-t emésztettünk Hind III és Hpal enzimekkel. Az összetartó végeket tompa végekké hosszabitottuk meg Klenow Pol I alkalmazásával. A DNS-t BAP-pal kezeltük, és azt a vektor töredéket különítettük el és tisztítottuk (2. töredék), amely az SV 40 korai promotort, az ampicillinnel szembeni rezisztenciát biztosító géneket és a reprodukció eredetét tartalmazta. 5 Mg mennyiségű p preUK54trp207-l plazmidot emésztettünk Clal és XBal enzimekkel. Az összetartó végeket meghosszabbitot=tuk Klenow Pol I segítségével, és az 54 kdalton molekulatömegű eló-urokinázt kódoló DNS töredéket különítettük el és tisztítottuk (3. töredék). Mintegy 100 ng mennyiségű 2. töredéket és körülbelül 100 ng mennyiségű 3. töredéket összekapcsoltunk egy éjszakán át 14 °C-on, és a termékkel Escherichia coli 294 törzset transzformáltunk. Az egyik transzformációs termékből kinyert, pEH3-BAL14 preUK54 elnevezésű plazmid DNS restrikciós endonukleázzal végzett analizise megerősítette a helyes szerkezetet. Ezután a pEH3-BAL14 preUK54 DNS-t felhasználtuk majomsejtek (62) átfertőzésére preUK54 termelése és a teljes hosszúságú, nagy molekulatömegű urokináz kiválasztása céljából. Elkülönítés és jellemzés Az urokináztartalmú maradékot elkülönítettük az Escherichia coli tenyészetből. A maradékot olyan pH = 8 értékű oldatban oldottuk, amely 5M guanidin-hidrokloridot és 50 mM triszt tartalmazott. Az oldatot addig hígítottuk, amíg a guanidin-hidroklorid koncentrációja 1M, a trisz-hidroklorid koncentrációja 50 mM (pH = 9), a fehérjekoncentráció pedig 1 ng/ml nem lett. Az oldathoz ezután hozzáadtunk 2 mM redukált glutationt és 0,2 mM oxidált glutationt (GSH illetve GSSG), és egy éjszakán át inkubáltuk szobahőmérsékleten. A fehérjét tartalmazó oldatot ezután vizes közegbe dializáltuk. A kapott oldat urokinázt tartalmazott, amelynek aktivitása mg-onként 100 PU (plough unit) volt. A hagyományos módszerekkel történt tisztítás után a fehérje tartalmazta a kis molekulatömegű biológiailag aktív anyag mindkét láncára vonatkozó, várt, nitrogénatomban végződő szekvenciát. A szénatom végződés analizise is a megfelelő szekvenciát mutatta mindkét láncra vonatkozólag. A fehérje körülbelül 30 000 dalton molekulatömegnél vándorolt. A fajlagos aktivitása 170 000 PU/mg 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
