202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
17 HU 202279 B 18 A pPS20 plazmid a jelen találmány szerinti egyik kifejeződő vektor, amely példáját nyújtja olyan típusú vektoroknak, amelyek az izopenicillin N-szintetáz aktivitás intracelluláris koncentrációjára vannak tervezve egy Ö-laktám antibiotikum-termelő gazdasejtben. A pPS20 plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pIT221 plazmid ~ 2,7 kb-s Hindlll restrikciós fragmensót beiktatjuk a pIT335 plazmid egyedi Hindi II restrikciós enzim felismerő helyébe. A pIT221 plazmid ~ 2,7 kb-s Hindlll restrikciós fragmense magában foglalja a Saccharomyces cerevisiae élesztő foszfoglicerát kináz (PGK) gén átiró és transzlációs aktiváló szekvenciáját a korrekt helyzetben és orientációban ligáivá, hogy elősegítse a higromicin rezisztencia-átadó gén kifejeződését. Mivel a pIT221 plazmid ~ 2,7 kb-s Hindlll restrikciós fragmensét be lehet iktatni a W/ndlII-al emésztett pIT335 plazmidba a két orientáció bármelyikébe, a ligálás, amely a pPS20 plazmidot hozza létre, termel egy funkcionálisan ekvivalens izomert is, amelyet pPS20.1-nek nevezünk. A pPS20 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 5. ábrában mutatjuk be; a pPS20 és pPS20.1 plazmidok megalkotását a 4. példában Írjuk le. A pPS20 és pPS20.1 plazmidok megalkotásában kiindulási anyagként használt pIT221 plazmid a 654,919 bejelentési sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésbe van foglalva és ott igénypontok tárgya, az ezzel kapcsolatos ügyvédi feljegyzés száma X-6570, a bejelentés benyújtva 1984. szeptember 27-én. Ez a 654,919 bejelentési sorszámú szabadalmi bejelentés az I-VI. folyamatábrákban és 29-57. oldalakon az 1-6. példákban leírja a pIT221 plazmid megalkotását, ez a bejelentés ebbe a bejelentésbe referenciaként van beépítve. A pIT221 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 4. ábra mutatja. A pIT221 plazmid ~ 2,7 kb-s Hindlll restrikciós fragmense magában foglal egy higromicin rezisztenciát adó gént, amely az élesztő PGK átiró és transzlációs aktiváló szekvenciájához van ligáivá a korrekt helyzetben és orientációban a higromicin rezisztencia átadó aktivitás (HmR) kifejeződéséhez. Amint ez a 654,919 bejelentési sorszámú amerikai egyesült államokbeli bejelentésben benne foglaltatik, a PGK-HmR gént lehet használni Cephalosporium acremonium és rokon gazdasejtek transzformálására, a higromicin-rezisztens fenotípus kialakítására. A pPS20 plazmid magában foglalja a PGK-HmR gént, és a Cephalosporium acremonium/pPS20 transzformánBokat a tranezformánsok által kifejezett higromicin rezisztencia-átadó aktivitás alapján lehet kiválasztani. A pPS20 plazmid tartalmazza a jelen találmány szerinti, izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-t is a genom DNS-sel együtt, amely szegélyezi az izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-t a Cephalosporium acremonium genomban. Mivel a pPS20 plazmid magában foglalja a genom DNS-ből azt a csaknem 3 kb-t, amely az izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-tól .felfelé' helyezkedik el a Cephalosporium acremonium genomban, a pPS20 plazmid szükségszerűen magában foglalja az izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS átiró és transzlációs aktiváló szekvenciáját. A legtöbb átíró és transzlációs aktiváló szekvencia az aktiválandó DNS-tól .felfelé' kódolódik, bár néhány riboszomális RNS-kódoló DNS szekvenciát olyan átíró aktiváló szekvenciák aktiválnak, amelyek nem a kódoló területtől .felfelé' helyezkednek el. A .felfelé' olyan kifejezés, amelyet a molekuláris biológia szakterületén alkalmaznak, és a jelen szövegösszefüggésben azt jelenti, hogy a DNS az 5’ irányban van izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS kódoló szálának 5’ végétől. A pPS20 plazmidon kódolt Cephalosporium acremonium átiró és transzlációs aktiváló szekvencia korrektül helyezkedik el, hogy elősegítse az izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS kifejeződését, mivel a pPS20 plazmid megalkotásában nincsenek átiró és transzlációs aktiváló szekvenciára ható deléciók vagy beiktatások bevezetve az izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló szál 5’ végét szegélyező DNS-be. A pPS20 plazmidot használjuk ezért a Cephalosporium acremonium és rokon gazdasejtek antibiotikum-termelő képességének és hatékonyságának növelésére, amely gazdasejtekben a C. acremonium átiró- és transzlációs aktiváló szekvencia működik. Ez a megnövekedett antibiotikum-termelő képesség és hatékonyság az izopenicillin N-szintetáz aktivitás megnövekedett szintjének tulajdonítható a transzformánsban, ez pedig az izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS további, kifejezett kópiái jelenlétének tulajdonítható. A pPS20 plazmid tartalmaz higromicin rezisztencia átadó gént is, amely C. acremoniumban működik, és lehetővé teszi a C. acremonium/pPS20 transzformánsok kiválasztását. Miután a Cephalosporium acremonium/pPS20 transzformánsokat kiválasztottuk, nincs szükség fenntartani a kiválasztás kényszerét jelentő higromicin B jelenlétét a transzformánsok növesztő tápközegében. Nincs szükség a szelekció kényszerének fenntartására azért, mert a C. acremonium/pPS20 transzformánsok nagyon stabilak. Ez a stabilitás, úgy véljük, a C. acremoniumot kromoszomális integráció útján transzformáló pPS20 plazmidból ered. A jelen találmány azonban nem korlátozódik azokra a plazmidokra, amelyek C. acremoniumban segítik elő az izopenicillin N-szintetáz aktivitás kifejeződését és kromoszomális integrálás útján transzformáinak. C. acremoniumhoz extrakromoszomális replikáló kifejeződő vektorok könnyen alkothatok a 4 492 758 lajstromszá-11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 f>0 65
